المراقبة في الوقت الحقيقي لنمو البكتيريا باستخدام نظام زراعة القطرات الدقيقة الموائع الدقيقة

الملخص

المصدر: Jian، X. وآخرون، الزراعة الميكروبية الآلية والتطور التكيفي باستخدام نظام زراعة القطرات الدقيقة الميكروبية (MMC). J. Vis. خبرة. (2022)

يوضح هذا الفيديو استخدام منصة قائمة على قطرات الموائع الدقيقة لمراقبة نمو البكتيريا في الوقت الفعلي. من خلال توليد قطرات موحدة تحتوي على معلقات بكتيرية وتوجيهها عبر مسار الكشف ، يتيح النظام القياس البصري المستمر لكثافة الخلية لبناء منحنى النمو.

البروتوكول

1. الاستعدادات

1. قم بتوصيل إبرة المحقنة (القطر الداخلي 0.41 مم والقطر الخارجي 0.71 مم) ، والموصل السريع A ، وزجاجة الكاشف (الشكل 1 ج) ، وقم بتعقيمها عند 121 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
   ملاحظه: قم بفك غطاء زجاجة الكاشف قليلا أثناء التعقيم. يمكن تحضير عدد قليل من زجاجات الكاشف في كل مرة للاستخدام.
2. استخدم مرشح فلوريد البولي فينيل لليدين (PVDF) 0.22 ميكرومتر لتصفية زيت نظام زراعة القطرات الدقيقة (MMC). ضع رقاقة الموائع الدقيقة (الشكل 1 ب) وزيت MMC في المقعد النظيف مسبقا وقم بتعقيمها بالأشعة فوق البنفسجية لمدة 30 دقيقة قبل الاستخدام.
   ملاحظه: للحصول على تفاصيل الموصل السريع A وزجاجة الكاشف وزيت MMC وشريحة الموائع الدقيقة ، راجع جدول المواد.
3. قم بتركيب شريحة الموائع الدقيقة
   1. افتح باب غرفة التشغيل (الشكل 1 أ) وارفع مسبار الألياف الضوئية.
   2. قم بمحاذاة فتحات المجال الكهربائي مع إبر المجال الكهربائي وضع الرقاقة برفق على قاعدة الشريحة. ثم أدخل عمودي تحديد المواقع في فتحات تحديد المواقع وضع مسبار الألياف الضوئية (الشكل 1 د).
   3. قم بتوصيل الموصل السريع A الموجود على الشريحة بالمنفذ المقابل ل MMC وفقا لرقم الموضع (C5-O5 ، C4-O4 ، C6-O6 ، C2-O2 ، CF-OF ، C1-O1 ، C3-O3). ثم أغلق باب غرفة العمليات.
4. قم بتجديد زيت MMC (إلى حوالي 80 مل) في زجاجة الزيت وأفرغ سائل النفايات في زجاجة النفايات قبل الاستخدام.
   ملاحظه: عادة ما يكون سائل النفايات نفايات عضوية. يرجى الرجوع إلى القانون واللوائح الإقليمية عند التخلص منها ، وتخضع للتغيير بناء على الإعداد التجريبي.

2. قياس منحنى النمو في MMC

1. التحضير للمحلول البكتيري الأولي
   1. اتبع اللوائح القياسية ذات الصلة لتحضير لوريا-بيرتاني (LB) الوسط والأوتوكلاف عند 121 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
      ملاحظه: مكونات وسط LB: كلوريد الصوديوم (10 جم / لتر) ، مستخلص الخميرة (5 جم / لتر) والتربتون (10 جم / لتر).
   2. أخرج سلالة الإشريكية القولونية MG1655 من مخزون الجلسرين وزرعها في قارورة مخفوقة سعة 50 مل مع 10 مل من وسط LB في حاضنة اهتزاز (200 دورة في الدقيقة) عند 37 درجة مئوية لمدة 5-8 ساعات.
      ملاحظه: يعتمد وقت الزراعة على السلالات المحددة. من الأفضل زراعة السلالة في الفترة / المرحلة اللوغاريتمية.
   3. قم بتخفيف محلول الإشريكية القولونية MG1655 المستزرع بوسط طازج إلى كثافة بصرية عند 600 نانومتر (OD₆₀₀) من 0.05-0.1 للحصول على محلول بكتيري أولي (تحضير حوالي 10 مل).
2. انقر فوق التهيئة لتهيئة MMC. بعد ظهور واجهة التهيئة ، اضبط درجة حرارة الزراعة على 37 درجة مئوية وقيمة الإشارة الكهروضوئية على 0.6 (الشكل 2 أ). ستستغرق التهيئة حوالي 20 دقيقة.
3. قم بتشغيل مصباح الأشعة فوق البنفسجية (الطول الموجي 254 نانومتر) أثناء التهيئة.
4. حقن محلول البكتيريا الأولي وزيت MMC في زجاجة الكاشف.
   1. أخرج زجاجة كاشف معقمة على المقعد النظيف وشد الغطاء.
   2. استخدم حقنة معقمة سعة 10 مل لحقن 3-5 مل من زيت MMC من إبرة حقنة الأنبوب الجانبي. قم بإمالة زجاجة الكاشف وتدويرها ببطء لجعل الزيت يتسلل بالكامل إلى الجدار الداخلي.
   3. حقن حوالي 5 مل من محلول البكتيريا الأولي ، ثم املأ زجاجة الكاشف عن طريق حقن 5-7 مل من الزيت مرة أخرى.
   4. اسحب الموصل السريع المستقل A ، وأدخل الموصل السريع A لزجاجة الكاشف في الموصل السريع B لإكمال عملية حقن العينة (الشكل 3 أ).
5. انتظر حتى تنتهي التهيئة ثم قم بإيقاف تشغيل مصباح الأشعة فوق البنفسجية (الطول الموجي 254 نانومتر).
6. افتح باب غرفة التشغيل ، وضع زجاجة الكاشف في الحمام المعدني.
7. اسحب الموصل C2 للشريحة والموصل السريع A لزجاجة الكاشف. قم بتوصيل موصل الأنبوب الجانبي لزجاجة الكاشف بالموصل C2 وموصل الأنبوب العلوي بموصل O2. ثم أغلق باب غرفة العمليات.
8. انقر فوق منحنى النمو لاختيار وظيفة قياس منحنى النمو (الشكل 2 أ). في واجهة إعداد المعلمة ، أدخل الرقم ك 15 ، وقم بتشغيل مفتاح الكشف عن OD ، واضبط الطول الموجي على 600 نانومتر. انقر فوق ابدأ لبدء توليد القطرات. سوف يستغرق حوالي 10 دقائق. ملاحظه: هنا ، يشير الرقم إلى عدد القطرات التي سيتم إنشاؤها. يشير الطول الموجي إلى الطول الموجي للOD المراد اكتشافه. اضبط الرقم (بحد أقصى 200) والطول الموجي (350-800 نانومتر) وفقا لمتطلبات التجربة.
9. عندما تظهر نافذة منبثقة على الواجهة الرئيسية تطالب ب "إزالة زجاجة الكاشف بين C2 و O2 ، ثم الرجاء النقر فوق الزر "موافق" بعد الانتهاء" ، افتح باب غرفة التشغيل لإخراج زجاجة الكاشف وتوصيل موصلات C2 و O2.
10. أغلق الباب ، وانقر فوق OK زر في النافذة المنبثقة لزراعة القطرات تلقائيا واكتشاف قيم OD.
    ملاحظه: يكتشف MMC قيمة OD عندما تمر القطرة بمسبار الألياف الضوئية. لذلك ، تعتمد فترة الكشف على عدد القطرات المتولدة.
11. عندما يصل منحنى النمو إلى المرحلة الثابتة ، انقر فوق تصدير البيانات زر لتصدير بيانات OD. حدد مسار حفظ البيانات وقم بتصدير قيمة OD المسجلة خلال فترة الزراعة بتنسيق .csv ، والتي يمكن فتحها بواسطة البرامج المناسبة (على سبيل المثال ، Microsoft Excel). ثم استخدم برنامج رسم الخرائط (على سبيل المثال ، EXCEL و Origin 9.0) لرسم منحنى النمو.
    ملاحظه: أثناء عملية الزراعة ، من الممكن النقر فوق تصدير البيانات في أي وقت لتصدير بيانات OD لجميع القطرات الحالية.

النتائج

الشكل 1: الهيكل والأدوات الأساسية ل MMC. (أ) الغرفة الخارجية والتشغيلية للجنة التنسيق الإدارية. (ب) رقاقة الموائع الدقيقة ل MMC. تحتوي الشريحة على سبع قنوات (C1-C6 و CF). (ج) زجاجة كاشف. يحتوي على أنبوب علوي وأنبوب جانبي. قبل حقن العينة في زجاجة الكاشف ، ...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
0.22 ميكرومتر غشاء مرشح PVDF	ميرك ميليبور المحدودة	SLGPR33RB	تعقيم زيت MMC
ثلاجة 4 درجة مئوية	هاير	BCD-289BSW	لتخزين الكاشف
اجار	بيكتون وديكنسون وشركاه	214010	لإعداد الألواح الصلبة
مقعد نظيف	بكين دونجليان هار أداة تصنيع المحدودة	دي إل سي جيه إندي	للعملية المعقمة والتعقيم بالأشعة فوق البنفسجية
حاسوب	لينوفو	[إ450]	تثبيت البرامج والتحكم في MMC
حاضنة درجة حرارة ثابتة	شنغهاي qixin أداة علمية المحدودة	250 ر.هي.	للزراعة الميكروبية باستخدام وسط صلب
الميزان الإلكتروني	أوهاوس	3130 ريال	لوزن الكاشف
أنبوب EP	ثيرمو فيشر	1.5 مل	لجمع القطرات
أنبوب التجميد	ثيرمو فيشر	2.0 مل	للحفاظ على الإجهاد
الجلسرين	كاشف عام	G66258A	للحفاظ على الإجهاد
وعاء تعقيم بالبخار عالي الضغط	سانيو إلكتريك	MLS3020	للتعقيم المعقم
نظام زراعة القطرات الميكروبية (MMC)	لويانغ TMAXTREE التكنولوجيا الحيوية المحدودة	إم إم سي آي	إجراء تحديد منحنى النمو والتطور التكيفي. يرجى الرجوع إلى http://www.tmaxtree.com/en/index.php?v=news&id=110
رقاقة الموائع الدقيقة	لويانغ TMAXTREE التكنولوجيا الحيوية المحدودة	إم إم سي - ألي-أود	لعمليات القطرات المختلفة. يرجى الرجوع إلى http://www.tmaxtree.com/en/
زيت MMC	لويانغ TMAXTREE التكنولوجيا الحيوية المحدودة	MMC-M / S-OD	مرحلة الزيت للموائع الدقيقة للقطرات. يرجى الرجوع إلى http://www.tmaxtree.com/en/
كلوريد الصوديوم	كاشف عام	G81793J	مكون من وسط LB
طبق بتري	كورنينج إنكوربوريتد	90 مم	لإعداد الوسط الصلب
ماصه	إيبندورف	2.5 ميكرولتر ، 10 ميكرولتر ، 100 ميكرولتر ، 1000 ميكرولتر	للتعامل مع السوائل
موصل سريع أ	لويانغ TMAXTREE التكنولوجيا الحيوية المحدودة	—	لتوصيل كل مفصل. يرجى الرجوع إلى http://www.tmaxtree.com/en/
زجاجة كاشف	لويانغ TMAXTREE التكنولوجيا الحيوية المحدودة	MMC-ثنائي الفينيل متعدد الكلور	أخذ عينات وتخزين محلول البكتيريا والكواشف. يرجى الرجوع إلى http://www.tmaxtree.com/en/
قارورة رج	الاتحاد للتكنولوجيا الحيوية	50 مل	للزراعة الميكروبية
حاضنة اهتزاز	شنغهاي سوكون الصناعية المحدودة	سكاي -210 2 ب	للزراعة الميكروبية في قارورة مخفوق
حقنة	جيانغسو تشيو التعليمات الطبية المحدودة	10 مل	اسحب السائل وحقنه في زجاجة الكاشف
إبرة حقنة	متجر لاجهزة الكمبيوتر OUBEL	22 جرام	القطر الداخلي 0.41 مم والقطر الخارجي 0.71 مم.
التربتون	أوكسيد المحدودة	إل بي 0042	مكون من وسط LB
ثلاجة درجة حرارة منخفضة للغاية	سانيو فائق الانخفاض	MDF-U4086S	للحفاظ على الإجهاد (-80 درجة مئوية)
مقياس الطيف الضوئي للأشعة فوق البنفسجية	شركة جنرال إلكتريك	Ultrospec 3100 pro	لقياس قيم OD
مستخلص الخميرة	أوكسيد المحدودة	LP0021	مكون من وسط LB