التحول الطبيعي والتعبير عن GFP في البكتيريا الزرقاء الخيطية Phormidium gapuna

الملخص

المصدر: ويبر ، ن. ، وآخرون ، التحول الطبيعي ، وتعبير البروتين ، والحفاظ على التبريد للبكتيريا الزرقاء الخيطية Phormidium lacuna. J. Vis. خبرة. (2022)

يصف هذا الفيديو إجراء لإجراء التحول الطبيعي في البكتيريا الزرقاء الخيطية باستخدام الحمض النووي البلازميد لتحقيق تعبير GFP مستقر ومقاومة للمضادات الحيوية من خلال إعادة التركيب المتجانس.

البروتوكول

1. التحول الطبيعي والتعبير عن GFP

ملاحظه: يعتمد التحول على ناقل البلازميد المنتشر في الإشريكية القولونية (الإشريكية القولونية). يمكن استخدام pGEM-T أو pUC19 كناقلات للعمود الفقري. يتم وصف أمثلة على ناقلات تعبير البروتين الفلوري الأخضر (sfGFP) في قسم النتائج التمثيلية.

1. قم بتنفيذ جميع الخطوات باستخدام مادة معقمة في ظروف معملية معقمة (مقعد نظيف ، أواني زجاجية معقمة).
2. تلقيح 2 × 50 مل من وسط سائل f / 2 في قارورتين سعة 250 مل مع 2 × 1 مل من خيوط ثغرة Phormidium (P. lacuna) من ثقافة جارية. يزرع في الضوء الأبيض (50 ميكرولتر ^{م 2} س ^-1) تحت التحريض (الدوران الأفقي ، 50 دورة في الدقيقة) لمدة ~ 5 أيام عند 25 درجة مئوية.
3. قم بإعداد ~ 200 ميكروغرام من الحمض النووي لناقل التحويل باستخدام مجموعة إعداد ميدي وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
4. قم بتجانس 100 مل من تعليق الخلية P. lacuna (انظر جدول المواد) عند 10,000 دورة في الدقيقة لمدة 3 دقائق. قم بقياس OD عند 750 نانومتر (القيمة المطلوبة = 0.35).
5. قم بالطرد المركزي لتعليق الخلية لمدة 15 دقيقة عند 6,000 × جم. قم بإزالة المادة الطافية الحبيبات في 800 ميكرولتر (الحجم الإجمالي بما في ذلك السائل المتبقي والخيوط) من السائل المتبقي ووسط f / 2 ⁺ الإضافي.
6. خذ ثمانية ألواح f / 2⁺ باكتو أجار (قطر 10 سم) تحتوي على 120 ميكروغرام / مل كانامايسين. ماصة 10 ميكروغرام من الحمض النووي في منتصف كل صفيحة أجار. قم بسحب الماصة على الفور 100 ميكرولتر من تعليق الخلية في منتصف كل لوحة أجار (أعلى الحمض النووي).
7. احتفظ بلوحة الأجار بدون غطاء على المقعد النظيف للسماح للسائل الزائد بالتبخر. أغلق الطبق وقم بزراعته في الضوء الأبيض عند 25 درجة مئوية لمدة يومين.
8. وزع خيوط كل صفيحة أجار بحلقة تلقيح على عدة ألواح باكتو أجار جديدة f / 2 ⁺ تحتوي على 120 ميكروغرام / مل كانامايسين. قم بزراعة الألواح في الضوء الأبيض عند 25 درجة مئوية وفحص الثقافات بانتظام تحت المجهر.
9. تحديد الخيوط الحية المحولة بعد 7-28 يوما تحت المجهر. ابحث عن خيوط خضراء صحية (الشكل 1) تختلف عن الخيوط الأخرى. إذا كان من الممكن تحديد هذه الخيوط الخضراء ، فاستمر في الخطوة التالية ؛ خلاف ذلك ، احتفظ باللوحة لمدة 7 أيام أخرى.
10. استخدم الملقط لنقل هذه الخيوط الحية المحددة إلى 50 مل من السائل f / 2⁺ وسط مع 250 ميكروغرام / مل كانامايسين. ازرع في الضوء الأبيض عند 25 درجة مئوية على شاكر (دوران أفقي ، 50 دورة في الدقيقة). راقب النمو لمدة تصل إلى أربعة أسابيع.
11. انقل الخيوط مرة أخرى إلى وسط أجار يحتوي على 250 ميكروغرام / مل كانامايسين وانتظر حتى تنمو الخيوط. بعد عدة أيام ، انقل خيوطا مفردة إلى صفيحة أجار طازجة بتركيز أعلى من الكاناميسين ، على سبيل المثال ، 500 ميكروغرام / مل. احتفظ باللوحة الأصلية.
12. تأكد من نشر الخيوط بتركيز عال من الكاناميسين في الثقافة السائلة أو على الأجار. زيادة تركيز الكاناميسين مرة أخرى لتسريع الفصل. ملاحظه: ينمو P. lacuna المحولة في ما يصل إلى 10,000 ميكروغرام / مل kanamycin. قد لا تتسامح الأنواع الأخرى مع مثل هذه التركيزات العالية.
13. لتعبير GFP: راقب خيوطا مفردة بمجهر مضان عند تكبير الهدف المحدد عند 40x أو 63x. التقط صورة نقل المجال الساطع وصورة مضانة. استخدم الإعدادات التالية ل GFP: ممر نطاق 470 نانومتر للإثارة ، وممر نطاق 525 نانومتر للإرسال ، ومقسم شعاع 495 نانومتر ، ووقت التعرض الأولي 500 مللي ثانية.
14. اضبط وقت التعرض لإشارات مضان واضحة ، وتجنب شدة التشبع. حاول استخدام الإعداد نفسه لجميع العينات.
15. نظرا لأن الخيوط من النوع البري ستعرض أيضا مضان ، التقط صورا بنفس الإعدادات المذكورة أعلاه لمضان الخلفية هذا. ملاحظة: يجب أن يكون للسلالة التي تعبر عن GFP إشارة أعلى. خلاف ذلك ، فإنه لا يعبر عن GFP.
16. بناء على أوقات التعرض وشدة البكسل لصور التألق ، احسب وقارن محتوى GFP للخيوط المختلفة.

النتائج

الشكل 1.خيوط فورميديوم ثغرات بعد 5 أسابيع من التحول. تم استخدام متجه تعبير sfGFP pMH1 ؛ حدث الانتقاء على وسط f / 2 مع 120 ميكروغرام / مل كاناميسين. الخيوط الخضراء مقاومة وحية. ماتت خيو...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
باكتو أجار	أوتونوروالد	214010
مجهر مضان ApoTome	زييس
مجهر مضان Axio Imager 2	زييس
كاناميسين	سيجما ألدريتش	25389-94-0
مجهر DM750	زييس
طقم استخراج البلازميد الإعدادية Midi مجموعة NucleoBond Xtra Midi	Macherey-NAGEL GmbH & Co. KG	REF740410.50
مصدر الضوء ، أنبوب الفلورسنت L18W / 954 ضوء النهار	أوسرام		زراعة البكتيريا الزرقاء
مصدر الضوء ، لوحة LED XL 6500K 140 واط	بلوم ستار	غير متاح	زراعة البكتيريا الزرقاء
أطباق بتري بوليسترول، 100 مم × 20 مم	ميرك	P5606-400EA
أطباق بتري بوليسترول، 60 مم × 15 مم	ميرك	P5481-500EA
بيبتمان 100-1,000 ميكرولتر	جيلسون	رمز المنتج: FA10006M
بيبتمان 10-100 ميكرولتر	جيلسون	رمز المنتج: FA10004M
ماصات بلاستيكية 10 مل ، معقمة	غرينر	607107
شاكر يونيماكس 2010	آلات هايدولف		للزراعة
أنبوب بلاستيكي ، معقم ، 50 مل	غرينر	227261
الكسارة الصامتة Ultraturrax M	آلات هايدولف		الخالط
F / 2+ وسط سائل	f / 2-متوسطة ، مع زيادة 10 مرات NaNO₃ و NaH₂PO₄ (0.88 ملي NaNO₃ ، 36 ميكرومولار NaH₂PO₄
f / 2 + - أجار	3٪ (وزن / حجم) باكتو أجار ، مياه البحر الاصطناعية ، محلول العناصر النزرة 0.1٪ (حجمي / حجمي) ، محلول فيتامين 0.05٪ (حجمي / حجمي) ، 8.8 ملي نانوموذرات النوديوم ، 0.36 ملي مولار هيدروكسيد الصوديوم ₂PO₄