توليد طفرات تحمل علامة المضادات الحيوية في البكتيريا الزرقاء عن طريق إعادة التركيب المتماثل

الملخص

المصدر: ليا سميث ، دي جيه ، وآخرون. توليد طفرات ملحوظة وبدون علامات في الأنواع الزرقاء النموذجية. J. Vis. خبرة. (2016)

يوضح الفيديو طريقة لتوليد طفرات تحمل علامة المضادات الحيوية في البكتيريا الزرقاء. يبدأ البروتوكول بزراعة البكتيريا الزرقاء ، تليها خطوات الطرد المركزي والغسيل التي تحافظ على السطح. ثم يتم إدخال بلازميد يحمل جين مقاومة للمضادات الحيوية محاط بتسلسلات متجانسة. أثناء الحضانة ، يتم استيعاب البلازميد عبر بيلي واستبدال الجين المستهدف من خلال إعادة التركيب المتماثل. يتم استخدام اختيار المضادات الحيوية وإعادة إعادتها لعزل وتنقيتها السلالة المتحولة.

البروتوكول

1. إعداد الإعلام الثقافي
   1. تحضير متوسط أزرق أخضر 11 (BG11 متوسط) وفقا ل Castenholz (1988).
      1. قم بإعداد محاليل مخزون من 100x BG11 والعناصر النزرة ومخزون الحديد (الجدول 1).
      2. قم بإعداد محاليل منفصلة من مخزون الفوسفات ، ومخزون كربونات الصوديوم (Na₂CO₃) ، ومخزن مؤقت N- [Tris (hydroxymethyl) methyl] -2-aminoethanesulfonic acid (TES) ، وبيكربونات الصوديوم (NaHCO₃) (الجدول 1).
      3. الأوتوكلاف مخزون الفوسفات وحمض الكربون الصومومني. قم بتعقيم المخزن المؤقت TES و NaHCO₃ بمرشحات 0.2 ميكرومتر.
      4. قم بإعداد BG11 عن طريق الجمع بين 976 مل من الماء ، و 10 مل من 100x BG11 ، و 1 مل من العناصر النزرة ، و 1 مل من مخزون الحديد ، وقم بتعقيم المحلول. بعد أن يبرد هذا المحلول إلى درجة حرارة الغرفة ، أضف 1 مل من مرق الفوسفات ، و 1 مل من مخزون Na₂CO₃ ، و 10 مل من NaHCO₃.
      5. بالنسبة للوسط الصلب BG11 ، أضف 15 جم من الأجار و 700 مل من الماء إلى قارورة واحدة. إلى القارورة الثانية ، أضف 3 جم من ثيوسلفات الصوديوم (Na₂S₂O₃) ، و 226 مل من الماء ، و 10 مل من 100x BG11 ، و 1 مل من العناصر النزرة ، و 1 مل من مخزون الحديد. الأوتوكلاف كلا الحلين. بعد أن تبرد هذه المحاليل إلى درجة حرارة الغرفة ، امزجها وأضف 1 مل من مخزون الفوسفات ، و 1 مل من مخزون Na₂CO₃ ، و 10 مل من TES buffer ، و 10 مل من NaHCO₃.
         ملاحظه: يتم تحضير المحاليل بشكل منفصل لتجنب هطول بعض الأملاح.
2. للاختيار على السكروز ، قم بإعداد محلول سكروز بنسبة 50٪ (وزن / حجم). قم بالفلتر وتعقيم المحلول بمرشحات 0.2 ميكرومتر وأضفه إلى BG11 (100 مل من 50٪ سكروز إلى 900 مل من BG11) لإنتاج ألواح السكروز BG11 / 5٪.
   ملاحظه: لا تضيف NaHCO₃ إلى ألواح أجار السكروز BG11 / 5٪. أضف Na₂CO₃ كالمعتاد.
3. لزراعة المكورات الاصطناعية ، أضف 10 مل من 1 م 4- (2-هيدروكسي إيثيل) بيبرازين -1-حمض إيثانيسلفونيك ، N- (2-هيدروكسي إيثيل) بيبرازين - N - (2-حمض إيثانيسلفونيك) (HEPES) ، و 1 مل من فيتامين ب 12 (الجدول 1) إلى 1 لتر من وسط BG11.
   ملاحظه: يعد تحويل السلالات المستزرعة في وسائط BG11 المتاحة تجاريا أقل كفاءة بكثير مما هو عليه في وصفات وسائط BG11 الموضحة هنا ، وبالتالي ، لا ينصح به.

الجدول 1: الحلول المستخدمة في هذه الدراسة.

وصفات محلول الأسهم
كيميائي	المبلغ (غ)
100x BG11 (لكل لتر)
NaNO₃	149.6
MgSO₄·7H₂O	7.49
CaCl₂·2H₂O	3.6
حامض الستريك	0.6
أضف 1.12 مل 0.25 M Na₂EDTA ، درجة الحموضة 8.0
0.25 M Na₂EDTA ، درجة الحموضة 8.0 (لكل 100 مل)
Na₂EDTA	9.3
العناصر النزرة (لكل 100 مل)
H₃BO₃	0.286
MnCl₂·4H₂O	0.181
ZnSO₄·7H₂O	0.022
Na₂MoO₄·2H₂O	0.039
CuSO₄ · 5H₂O	0.008
Co (NO₃) ₂ · 6H₂O	0.005
مخزون الحديد (لكل 100 مل)
سترات الأمونيوم الحديديك	1.11
مخزون الفوسفات (لكل 100 مل)
K₂HPO₄	3.05
مخزون Na2CO3 (لكل 100 مل)
Na₂CO₃	2
مخزن مؤقت TES ، درجة حموضة 8.2 (لكل 100 مل)
TES	22.9
مخزون NaHCO3 (لكل 100 مل)
NaHCO₃	8.4
HEPES ، درجة حموضة 8.2 (لكل 500 مل)
HEPES	119.15
فيتامين ب₁₂ (لكل 50 مل)
سيانوكوبالامين	0.02
لوريا بيرتاني ميديا (لكل 500 مل)
مرق لوريا بيرتاني	12.5
1 مليون MgCl₂ (لكل 100 مل)
MgCl₂·6H₂O	20.33
المحلول أ (لكل 200 مل)
MnCl₂·4H₂O	0.395
CaCl₂·2H₂O	1.47
2- (N-مورفولينو) هيدرات حمض إيثانيسلفونيك ، 4-حمض مورفولين إيثان سلفونيك (MES)	0.4265
الحل أ + الجلسرين
10 مل محلول أ
1.5 مل جلسرين

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

2. نمو سلالات البكتيريا الزرقاء

1. سلالات الاستزراع في قوارير مخروطية 100 مل بحد أقصى 50 مل وتهتز بمعدل 120 دورة في الدقيقة (دورة في الدقيقة). قم بإغلاق ألواح BG11 باستخدام Parafilm وثقب ثلاثة ثقوب صغيرة في جانب اللوحة للسماح بتبادل الغازات. احتضان جميع السلالات عند 30 درجة مئوية تحت بصيلات الفلورسنت في مفاعل ضوئي حيوي بكثافة ضوء تتراوح بين 20-40 ميكرولتر فوتونات م -2 ثانية -1.
2. استخدم أفضل تقنيات التعقيم. تعامل مع جميع سلالات البكتيريا الزرقاء في غطاء التدفق الرقائقي.
   ملاحظه: هذا مهم بشكل خاص عندما يتم استزراع السلالات باستخدام وسائط تحتوي على السكروز ، والتي يمكن أن تتلوث بسهولة.

3. توليد تركيبات البلازميد

1. تصميم مجموعات من البادئات ، بما في ذلك مواقع إنزيم التقييد المطلوبة ، باستخدام برنامج تصميم التمهيدي مثل Primer3 (http://frodo.wi.mit.edu/primer3/) ، لتضخيم منطقتين ~ 1 كيلو بايت 5 'و 3' من الجين محل الاهتمام. استشر تسلسل الجينوم لأنواع البكتيريا الزرقاء عبر Cyanobase (http://genome.kazusa.or.jp/cyanobase). انظر الجدول 2 لجميع البادئات المستخدمة هنا. عند تصميم الاشعال ، ضع في اعتبارك العوامل التالية:
   1. تأكد من أن المناطق المضخمة تشمل مناطق 5 و 3 من الجين الذي سيتم تحوره ، على سبيل المثال ،. الشكل 1.
   2. لا تقم بتغيير المناطق بين الجينات لتجنب الطفرة غير المقصودة للحمض النووي الريبي المضاد للمعنى وغير المشفر.
   3. عند اختيار المناطق المرافقة ، لا تقم بتضمين إطار القراءة المفتوح بالكامل للجينات المجاورة ، لأن التعبير عن هذه الجينات في الإشريكية القولونية قد يتداخل مع الاستنساخ.
2. قم بتضخيم المنتجات عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) باستخدام بوليميراز الحمض النووي عالي الدقة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
   ملاحظه: في تجربتنا ، ينتج هذا الإنزيم أخطاء قليلة.
   1. قم بإعداد تفاعلات تفاعل تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) 50 ميكرولتر تحتوي على مخزن مؤقت عالي الدقة (HF) وإما 0 أو 1.5 أو 3 ميكرولتر من ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO). استخدم 100 نانوغرام من الحمض النووي الجيني لكل تفاعل. استخدم برنامجا يتكون من خطوة تمسخ أولية تبلغ 98 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، و35 طلقة من 98 درجة مئوية لمدة 10 ثوان، و67 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، و72 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، متبوعة بخطوة تمديد نهائية تبلغ 72 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. هذا عادة ما يعطي منتجات متسقة.
3. تحقق من منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل والعينات التي تم هضمها باستخدام إنزيمات نوكلياز داخلية للحجم الصحيح عن طريق الرحلان الكهربائي للهلام. قم بتشغيل 1٪ (وزن / حجم) من المواد الهلامية الاغاروز التي تحتوي على 0.02٪ (حجم / حجم) من بروميد الإيثيديوم لمدة 45 دقيقة عند 100 فولت.تنبيه: بروميد الإيثيديوم مطفر محتمل ويجب التعامل معه بحماية مناسبة.
4. قم بتنقية منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام مجموعة تنقية الحمض النووي وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. أيضا ، استخدم هذه المجموعة لتنقية شظايا البلازميد ، بما في ذلك القطع المقطوعة من المواد الهلامية الاغاروز. الحمض النووي المنقى في 14 ميكرولتر من الماء.
5. لخطوات الاستنساخ ، احتضن مخاليط تفاعل نوكلياز داخلي عند 37 درجة مئوية لمدة >1 ساعة بحجم إجمالي يبلغ 30 ميكرولتر وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
6. بالنسبة لخطوات الربط ، قم بربط شظايا الحمض النووي في درجة حرارة الغرفة لمدة >1 ساعة بحجم إجمالي قدره 20 ميكرولتر ، تحتوي على 5 ميكرولتر من البلازميد المنقى المهضوم ، و 12 ميكرولتر من الملحق المنقى المهضوم ، و 2 ميكرولتر من المخزن المؤقت ، و 1 ميكرولتر من الليغاز.
7. تحضير الخلايا المحولة الإشريكية القولونية DH5α وفقا للطريقة التالية.
   1. ازرع مزرعة الإشريكية القولونية بين عشية وضحاها في 10 مل من لوريا بيرتاني (LB).
   2. تلقيح 400 مل رطل في قارورة مخروطية سعة 1 لتر تحتوي على 6 مل 1 م MgCl₂ (الجدول 1) مع 1 مل من المزرعة الليلية.
   3. قم بزراعة المزرعة عند 37 درجة مئوية عند 220 دورة في الدقيقة لمدة 4 ساعات تقريبا أو حتى يصل OD₆₀₀₀nm إلى 0.4-0.6.
   4. ضع الخلايا على الجليد لمدة 1 ساعة.
   5. جهاز طرد مركزي عند 2,800 × جم لمدة 10 دقائق لخلايا الحبيبات عند 4 درجات مئوية.
   6. قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليقه في محلول 160 مل أ (الجدول 1) واحتضنه على الثلج لمدة 20 دقيقة.
   7. جهاز طرد مركزي عند 2,800 × جم لمدة 10 دقائق لخلايا الحبيبات عند 4 درجات مئوية.
   8. قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليقه في محلول A + جلسرين 4 مل (الجدول 1).
   9. تحضير 50 ميكرولتر من الحصص ، قم بتجميدها في سائل N2 ، وتخزينها في درجة حرارة -80 درجة مئوية.
   10. امزج 5 ميكرولتر من خليط الربط مع 50 ميكرولتر من الخلايا المختصة واحتضان لمدة ساعة واحدة على الثلج.
   11. صدمة حرارية للخلايا عند 42 درجة مئوية لمدة 90 ثانية ، تليها الحضانة على الجليد لمدة دقيقتين.
   12. أضف 950 ميكرولتر من وسائط LB (الجدول 1) واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.
   13. Aliquot 50 و 200 ميكرولتر على أطباق تحتوي على المضاد الحيوي المناسب ، إما أمبيسلين (100 ميكروغرام / مل) و / أو كانامايسين (30 ميكروغرام / مل).
       أنذر: كل من الكاناميسين والأمبيسلين سامان ويجب التعامل معهما بحماية مناسبة.
   14. انتقاء واحتضان مستعمرات مفردة في 2 مل من وسط LB ملقح بالمضاد الحيوي المناسب.
8. قم بتنقية جميع البلازميدات باستخدام مجموعة تنقية البلازميد miniprep وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
9. قم بتوليد البلازميدات ، في هذا المثال المحدد للقضاء على جينات cpcC1C2 ، وفقا للخطوات التالية.
   1. قم بتضخيم المنطقة المحيطة ب 1,012 زوجا أساسيا (bp) 5 بوصات (الجزء الأيسر) باستخدام البادئات cpcC1C2leftfor و cpcC1C2leftrev (انظر الخطوة 3.2 ، الجدول 2). قم بإزالة كمية صغيرة من تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل وتأكد مما إذا كان المنتج بالحجم الصحيح قد تم تضخيمه عن طريق الرحلان الكهربائي الهلامي (الخطوة 3.3). استوعب هذا الجزء و pUC19 باستخدام XbaI و BamHI (الخطوة 3.5).
   2. قم بتنقية كلا المستحضرين (الخطوة 3.4) ، والربط (الخطوة 3.6) ، والتحويل (الخطوة 3.7) ، وإعداد أربع مزارع سائلة سعة 2 مل مع الأمبيسلين (100 ميكروغرام / مل) من مستعمرات منفصلة لتنقية البلازميد عبر minipreps (الخطوة 3.8).
   3. تحقق من إدخال الجزء في pUC19 عبر هضم XbaI / BamHI والرحلان الكهربائي للهلام (الخطوة 3.3). تشير العصابات التي تبلغ قوتها 2,660 نقطة أساس و 1,012 نقطة أساس إلى الإدخال الصحيح للإدخال في البلازميد.
   4. قم بتضخيم منطقة المحيطة 1,016 نقطة أساس 3 بوصات (الجزء الأيمن) باستخدام البادئات cpcC1C2rightfor و cpcC1C2rightrev (انظر الخطوة 3.2 ، الجدول 2). قم بإزالة كمية صغيرة من تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل وتأكد مما إذا كان المنتج بالحجم الصحيح قد تم تضخيمه عن طريق الرحلان الكهربائي الهلامي (الخطوة 3.3). استوض هذا الجزء و pUC19 باستخدام SacI و EcoRI (الخطوة 3.5).
   5. قم بتنقية كلا المستحضرين (الخطوة 3.4) ، والربط (الخطوة 3.6) ، والتحويل (الخطوة 3.7) ، وإعداد أربع مزارع سائلة سعة 2 مل مع الأمبيسلين (100 ميكروغرام / مل) من مستعمرات منفصلة لتنقية البلازميد عبر minipreps (الخطوة 3.8).
   6. تحقق من إدخال الجزء في pUC19 عبر هضم SacI / EcoRI (الخطوة 3.5) والرحلان الكهربائي للهلام (الخطوة 3.3). تشير العصابات التي تبلغ 2,660 نقطة أساس و 1,016 نقطة أساس إلى الإدخال الصحيح للإدخال في البلازميد. ملاحظة: يتم استخدام مواقع XbaI / BamHI لاستنساخ المنطقة 5 و SacI / EcoRI لاستنساخ المنطقة 3 'في pUC19 حيثما أمكن ذلك. إذا كان ذلك ممكنا ، فقم دائما بتضمين موقع BamHI على التمهيدي العكسي لمنطقة 5 'أو التمهيدي الأمامي للمنطقة 3' لضمان تسهيل تنفيذ خطوات الاستنساخ اللاحقة.
   7. تسلسل كلا الإدخالين لتحديد ما إذا كان التسلسل صحيحا باستخدام بادئات تمتد عبر موقع الإدخال ، على سبيل المثال ، M13 للأمام و M13 للخلف (الجدول 2). يجب أن يكون التسلسل صحيحا لضمان عدم إدخال أي أخطاء في المناطق المرافقة.
   8. استئصال الجزء الأيسر من pUC19 عبر هضم XbaI / BamHI. استضم الجزء الأيمن pUC19 + باستخدام XbaI / BamHI (الخطوة 3.5).
   9. قم بتنقية الجزء الأيسر 1,012 نقطة أساس و 3,676 نقطة أساس pUC19 + الجزء الأيمن من هلام الاغاروز (الخطوة 3.3) عن طريق استئصال الحمض النووي باستخدام شفرة مشرط.
   10. قم بتنقية كلا المستحضرين (الخطوة 3.4) ، والربط (الخطوة 3.6) ، والتحويل (الخطوة 3.7) ، وإعداد أربع مزارع سائلة سعة 2 مل LB مع الأمبيسلين (100 ميكروغرام / مل) من مستعمرات منفصلة لتنقية البلازميد عبر minipreps (الخطوة 3.8).
   11. تحقق من إدخال الجزء في الجزء الأيمن pUC19 + عبر هضم XbaI / BamHI (الخطوة 3.5) والرحلان الكهربائي للهلام (الخطوة 3.3). تشير العصابات التي تبلغ 3،676 نقطة أساس و 1،012 نقطة أساس إلى الإدخال الصحيح في البلازميد (راجع هذا باسم البلازميد B).
   12. استئصال كاسيت جين الفوسفوترانسفيراز النيومايسين / ليفانسوكراز (npt1 / sacB) من pUM24cm19 عبر هضم BamHI. هضم البلازميد B مع BamHI (الخطوة 3.5).
       ملاحظه: لا يلزم تنقية كاسيت npt1 / sacB من المواد الهلامية للاغاروز لأن pUM24cm يشفر بروتين يمنح مقاومة الكلورامفينيكول. لذلك ، إذا نمت المستعمرات على ألواح أجار LB / ampicillin / kanamycin ، فإن التركيبة الوحيدة الممكنة التي ستؤدي إلى مستعمرات مقاومة هي دمج كاسيت npt1 / sacB في البلازميد B.
   13. قم بتنقية كلا المستحضرين (الخطوة 3.4) ، والربط (الخطوة 3.6) ، والتحويل (الخطوة 3.7) ، وإعداد أربع مزارع سائلة سعة 2 مل مع الأمبيسلين (100 ميكروغرام / مل) والكانامايسين (30 ميكروغرام / مل) من مستعمرات منفصلة لتنقية البلازميد عبر التحضير الصغير (الخطوة 3.8).
   14. تحقق من إدخال كاسيت npt1 / sacB في البلازميد B عبر هضم BamHI (الخطوة 3.5) والرحلان الكهربائي للهلام (الخطوة 3.3). تشير العصابات التي تبلغ 4،688 نقطة أساس و 3،894 نقطة أساس إلى الإدخال الصحيح للإدخال في البلازميد (راجع هذا باسم البلازميد أ).

الجدول 2: الاشعال المستخدمة في هذه الدراسة. يتم تسطير مواقع نوكلياز داخلي التقييد.

التمهيدي	تسلسل
cpcC1C2leftfor	GTACTCTAGAGCGGCTAAATGCTACGAC
cpcC1C2leftrev	GATCGGATCCGGGTAATTGTTCCCTTTGA
cpcC1C2rightfor	GATCGAGCTGCACTGGTCAGTCGTC
cpcC1C2rightrev	GACTGAATTCATCGTTGCTTGAACGGTCTC
M13 إلى الأمام	TGTAAAACGACGGCCAGT
M13 عكس	كاغااااكاجكتاتجاك
cpcC1C2ل	GTTTTCATTGGCATCGGTCT
cpcC1C2rev	ATGTCCCAGGAACGACTGAC
A1173for	AGCAAACCGTTTTTGTGACC
طائرة A1173rev	TGCAAGGTGGCGAACTGTAT

 

 

4. توليد المسوخ المميز المميز والمكورات السينكوكوسية

1. قم بإعداد مزرعة جديدة عن طريق تلقيح حلقة مليئة بالخلايا في 30-50 مل من وسط BG11. قم بزراعة المزرعة لمدة 2-3 أيام إلى كثافة بصرية عند 750 نانومتر ، أو OD₇₅₀nm = 0.2 إلى 0.6.
   ملاحظه: عادة ما تكون المستعمرات الفردية صغيرة جدا بحيث لا يمكن استخدامها في التلقيح ، وسيؤدي تعرض الخلايا الفردية حتى لمستويات منخفضة من الضوء إلى تثبيط الضوء واختيار الطفرات المقاومة للضوء.
2. جهاز طرد مركزي 1-2 مل من المزرعة عند 2,300 × جم لمدة 5 دقائق وتخلص من المادة الطافية. لا تقم بجهاز طرد مركزي لأي مزارع بكتيريا زرقاء عند >2,300 × جم ، لأن ذلك قد يؤدي إلى تلف الخلايا. اغسل الحبيبات مرة واحدة بوسط BG11.
   ملاحظه: لا تقم بإعادة تعليق الخلايا عن طريق الدوامة ، لأن هذا قد يؤدي إلى فقدان الشعرية ، وهي ضرورية لامتصاص الحمض النووي. أعد تعليق الخلايا عن طريق السحب اللطيف.
3. أضف وسط BG11 إلى الحجم النهائي 100 ميكرولتر. انقل الخلايا إلى أنبوب دائري القاع سعة 14 مل.
4. أضف 1 ميكروغرام من البلازميد أ إلى الخلايا واخلطها بالنقر برفق. أضف <10 ميكرولتر من البلازميد.
   ملاحظه: يفضل أن يكون البلازميد بتركيز >100 نانوغرام / ميكرولتر ، لكن التركيزات الأقل من ذلك كافية للتحول الناجح.
5. ضع الأنابيب أفقيا في الحاضنة. احتضان الثقافات لمدة 4-6 ساعات.
   ملاحظه: يمكن خلط الخلايا لفترة وجيزة عن طريق النقر كل 1-2 ساعة ، لكن هذا ليس ضروريا. يمكن وضع العينات في حاضنة اهتزاز ، على الرغم من أن هذا لا يحسن الكفاءة بشكل كبير.
6. انشر كميات من خليط مزرعة الخلايا / البلازميد DNA على ألواح أجار BG11 بدون مضادات حيوية. عادة ، يتم توزيع 20 ميكرولتر و 80 ميكرولتر على ألواح منفصلة.
7. ~ 24 ساعة بعد ذلك ، أضف 2.5-3 مل من محلول أجار 0.6٪ في الماء المحتوي على كانامايسين (لكل 20 مل: 0.12 جم من أجار ، 100 ميكرولتر من 100 مجم / مل كانامايسين) إلى لوحة أجار. قم بتبريد هذا المحلول إلى ~ 42 درجة مئوية وأضفه إلى حافة لوحة الأجار. قم بإمالة اللوحة بحيث يشكل المحلول طبقة "أجار علوية" متساوية على السطح.
8. احتضان لوحات أجار لفترة أخرى من الزمن. يجب أن تكون المستعمرات مرئية بعد حوالي 7 أيام.
   ملاحظه: يمكن تكديس ألواح أجار بارتفاع 3 في حاضنة. عادة ، يتم الحصول على مئات المستعمرات لكل تحويل.
9. خطوط المستعمرات الفردية على BG11 + kanamycin (30 ميكروغرام / مل) لوحات أجار. قسم لوحة الأجار إلى 6 قطاعات واستخدم عود أسنان حاد لرسم المستعمرات فوق كل قطاع. الحصول على مستعمرات مفردة ليس مهما. فقط نمو المحولات هو.

النتائج

الشكل 1: بناء البلازميد لتوليد ضربات قاضية ملحوظة وغير مميزة ، على سبيل المثال ، cpcC1 و cpcC2 في Synechocy...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
NaNO₃	سيغما	س5506
MgSO₄·7H₂O	سيغما	230391
CaCl₂	سيغما	ج1016
حامض الستريك	سيغما	ج 0759
Na₂EDTA	صياد	EDT002
H₃BO₃	سيغما	339067
MnCl₂·4H₂O	سيغما	م3634
ZnSO₄·7H₂O	سيغما	Z4750
Na₂MoO₄·2H₂O	سيغما	331058
CuSO₄ · 5H₂O	سيغما	209198
Co (NO₃) ₂ · 6H₂O	سيغما	239267
سترات الأمونيوم الحديديك	سيغما	إف 5879
K₂HPO₄	سيغما	ص 3786
Na₂CO₃	صياد	SODC001
TES	سيغما	تي 1375
NaHCO₃	صياد	SODH001
HEPES	سيغما	[إتش3375]
سيانوكوبالامين	سيغما	47869
Na₂S₂O₃	سيغما	72049
باكتو أجار	دينار بحريني	214010
سكروز	صياد	SUC001
طبق بتري 90 مم ثلاثي التهوية	غرينر	633185
مرشحات 0.2 ميكرومتر	سارتوريوس	16534
100 مل قوارير مخروطية	بيركس	كوناتور 004
بارافيلم متر 100 مم × 38 م	بيميس	فيل003
Phusion عالية الدقة بوليميراز الحمض النووي	التصيد	إف -530
الاغاروز	ميلفورد	إم بي 1200
طقم تنقية الحمض النووي	موبيو	12100-300
نوكلياز التقييد	نيب
T4 ليغاز	ثيرمو ساينتفيك	EL0011
مرق لوريا بيرتاني	إنفيتروجين	12795-027
مس	سيغما	إم 8250
كبريتات الكاناميسين	سيغما	60615
الأمبيسيلين	سيغما	أ 9518
مجموعة GeneJET plasmid miniprep	ثيرمو ساينتفيك	ك 0503
14 مل أنبوب دائري القاع	BD الصقر	352059
الجلسرين	سيغما	جي 5516
DMSO	سيغما	D8418