اختبار فلوري عالي الإنتاجية لدراسة تفاعلات الميكروبات والدودة

الملخص

المصدر: علي، إ.، وآخرون. فحص عالي الإنتاجية للعزلات الميكروبية مع تأثير على صحة التهاب الجينورهابيديتس الدماغي . J. Vis. Exp. (2022)

يوضح هذا الفيديو اختبارا فلورية عالي الإنتاجية لتقييم كيفية تأثير بكتيريا الأمعاء على مرونة التوتر في التهاب الكاينورهابديتس الأمريكي. من خلال تتبع الفلورة الزرقاء الناتجة عن حبيبات الأمعاء الممزقة، يكشف الاختبار عن إشارات موت مبكرة في الديدان المعرضة لبكتيريا الاختبار.

البروتوكول

1. إعداد اختبار الصدمة الحرارية والأكسدة الخالية من العلامات Caenorhabditis elegans (C. elegans) (LFASS) لاختبار الصدمة الحرارية والتأكسد (الأيام 13 - 14)

1. قيم مرحلة تطور الديدان. بمجرد أن تصل >90٪ من الديدان إلى L4، اجمع الديدان في محلول M9 معقم يصل إلى 10 مل في أنابيب مخروطية بحجم 15 مل.
2. اغسل الديدان بشكل مكثف (على الأقل 4 مرات) عن طريق تدوير الديدان بحرارة 142xلمدة دقيقتين عند 4 درجات مئوية، وإزالة الفائق الفائق، وإضافة 10 مل من الديدان المعقمة الطازجة بين كل غسلة للتخلص من بكتيريا الإشريكية القولونية OP50. أعد تعليق حبيبة الدودة في 10 مل من M9.
3. انقل 50 ميكرولتر من محلول الدودة إلى أنبوب ارتباط منخفض السطح يحتوي على 950 ميكرولتر من M9. بعد خلط محتويات الأنبوب بلطف لتجنب ترسيب الديدان، استخدم بسرعة رأس ماصة منخفضة الارتباط مبللة لنقل 3-4 قطرات منفصلة بسعة 10 ميكرولتر إلى شريحة زجاجية أو لوح وسط نمو الديدان الخيطية (NGM). عد أعداد الديدان تحت المجهر المجسم بتكبير 16x. قم بمتوسط عدد القطرات من 3-4 قطرات وحدد عدد الديدان لكل ميكرولتر في محلول الدودة.
4. اضبط تركيز الدودة في أنبوب 10 مل ليصل إلى ~120 دودة في 8 ميكرولتر. إذا تم إعداد الحل في الخطوة 1.2. إذا لم تكن مركزة بما فيه الكفاية، قم بتدوير الديدان وإزالة M9 وفقا لذلك لتصل إلى 120 دودة لكل 8 ميكرولتر.
5. انقل 8 ميكرولتر من محلول الديدان (~120 دودة) إلى كل من آبار صفائح NGM-أغاروز الثمانية التي تحتوي على 96 بئرا تم إعدادها مسبقا، باستخدام ماصة متعددة القنوات أو ماصة تكرارية. تأكد من استخدام رؤوس منخفضة الاحتفاظ للحد من فقدان الديدان. قد يكون من الضروري أيضا قطع أطراف الديدان للسماح للديدان البالغة الكبيرة بتقليل الضغط الميكانيكي على الديدان البالغة.
   ملاحظه: يتطلب الفحص ما لا يقل عن 30 دودة حية سليمة ليعمل بشكل موثوق، لكنه يعمل بشكل أفضل مع حوالي 100 دودة في كل بئر.
6. حضن صفائح NGM-أغاروز المدعومة بالدودة والبكتيريا ببذور 96 بئر عند 25 درجة مئوية لمدة 36 ساعة.
7. افحص الألواح بين الساعة 12-24 ساعة، وتأكد من بقاء الديدان ممتلئة طوال الوقت. إذا كان هناك حاجة لإعادة التغذية، أعد تعليق البكتيريا داخل صفيحة مصفوفة بكتيرية مكونة من 96 بئر مخزنة عند 15 درجة مئوية، وأضف حتى 10 ميكرولتر من المحلول البكتيري المقابل إلى صفائح NGM-أغاروز ذات 96 بئر حيث تكون الديدان معرضة لخطر الجوع قبل نهاية فترة الحضانة التي تستمر 36 ساعة (الديدان الجائعة ستنتج نتائج مختلفة تماما، لذا هذا مهم جدا).
   ملاحظه: يجب إجراء الخطوات التالية في اليوم الخامس عشر. قبل بدء الاختبار، قد يكون من الضروري تحسين ارتفاع القراءة. سيتم تحقيق القراءة المثلى على ارتفاع 20-50 ميكرومتر فوق قاع البئر. هذا يعتمد على طراز قارئ اللوحة. بعضها يوفر إمكانية مسح Z، بينما يسمح البعض الآخر بإدخال الارتفاع يدويا. اضبط الارتفاع الأمثل عند المستوى الذي يتم فيه اكتشاف أعلى إشارة فلورية زرقاء (365 نانومتر/430 نانومتر). قد تعمل بعض قارئات الألواح على ارتفاع ثابت محسن لاختبارات الخلايا الملحقة، وقد لا تكون مثالية لاختبارات LFASS.
8. بعد 36 ساعة، يتم صرف 30 ميكرولتر من M9 في كل بئر من صفيحة 96 بئر.
   ملاحظه: بالنسبة لاختبارات الإجهاد الحراري، يجب أن يكون قارئ اللوحة قد وصل إلى درجة الحرارة المطلوبة لإجراء الاختبار وقد يحتاج إلى تشغيله مسبقا. يستخدم البروتوكول الحالي 42 درجة مئوية لتعظيم سرعة القتل، لكن هذا النهج ينطبق على درجات حرارة أخرى فوق 30 درجة مئوية.
9. نقل الديدان (حوالي 20 ميكرولتر) إلى صفيحة 384 بئر حسب التصاميم المحددة، باستخدام رؤوس منخفضة الاحتفاظ (فكر في قطع نهاية الأطراف للسماح للديدان الكبيرة بتقليل الإجهاد الميكانيكي للديدان البالغة).
   ملاحظه: في هذه الدراسة، يتم استخدام إعدادين مختلفين لقارئ الألواح للاختبارين الموصوفين هنا (الإجهاد الحراري والإجهاد التأكسدي)، وبالتالي، يجب ألا تطلأ العينات المخصصة لهذين الاختبارين في نفس الصفيحة ذات 384 البئر.
10. تأكد من ضبط قارئات الألواح بشكل صحيح (الجدول 1).
11. تم تزويد صفائح ال 384 بئر بمزيد من M9، مع هدف الوصول إلى حجم نهائي يبلغ 60 ميكرولتر لكل بئر. لاختبار الإجهاد الحراري، أضف 40 ميكرولتر من M9، وللضغط التأكسدي الناتج عن تيرت-بيوتيل هيدروكسيد (t-BHP)، أضف 34 ميكرولتر من M9 في 6 ميكرولتر من t-BHP.
    1. ابدأ الفحص خلال دقيقتين من إضافة t-BHP (من الناحية المثالية، يجب أن تتعرض جميع الديدان ل t-BHP في نفس الوقت، مع تحديد مدة الفحص دقيقتين). إذا لم يكن ذلك ممكنا، استخدم مؤقتا لتقدير الوقت الذي يقضيه في توصيل t-BHP قبل بدء الاختبار للسماح بتعديل وقت الوفاة الوسيط لاحقا.
12. أغلق الألواح بغطاءها الشفاف. أغلق حواف ألواح الحوض البالغ 384 بشريط لاصق (مع لصق فوق اللوحة والغطاء)، والتأكد من أن الشريط لا يمر فوق الغطاء أو تحت اللوحة. اقطع الشريط بين الغطاء واللوحة على فترات باستخدام مشرط للسماح بتبادل الهواء مع تقليل التبخر أثناء الفحص.
13. أدخل اللوحة في قارئ الألواح وابدأ التشغيل. استهدف الإثارة عند 365 نانومتر واكتشاف الانبعاث عند 435 نانومتر كل دقيقتين لمدة 6-12 ساعة (الجدول 1).
    ملاحظه: عادة، 6 ساعات تكفي لاختبارات الإجهاد الحراري بدرجة 42 درجة مئوية و8 ساعات لاختبارات الإجهاد التأكسدي بنسبة 7٪ t-BHP.

الجدول 1: إعدادات اختبار الإجهاد التأكسدي والإجهاد الحراري. أمثلة على الإعدادات المستخدمة في اختبارات إجهاد الأكسدة (A) والحرارة (B) على قارئات ألواح الفلورة المستخدمة في هذه الدراسة.

المواد