تقنية كروماتوغرافيا الألفة لتنقية بروتين بكتيري مؤتلف

الملخص

المصدر: بيكر، ب.، وآخرون. اختبار تقرير بسيط قائم على الفلورة لتحديد المكونات الخلوية المطلوبة لسلسلة سم الريسين A (RTA) في الخميرة. J. Vis. Exp. (2017).

يوضح هذا الفيديو تنقية بروتين مؤتلف مزود بعلامات متعددة الهيستيدين باستخدام كروماتوغرافيا الألفة القائمة على النيكل. يوضح الخطوات الرئيسية، بما في ذلك تحلل البكتيريا عن طريق السونيكشن، وتوضيح وترشيح الليزات، والارتباط الانتقائي والاستبعاد للبروتين المستهدف باستخدام الإيميدازول.

البروتوكول

1. تنقية RTA الموسوم بعلامة His عبر كروماتوغرافيا الألفة

1. خلايا سونيكيت على الجليد باستخدام البروتوكول التالي: نبضة 15 ثانية (20 ميكرون)، 30 ثانية توقف. كرر هذه الخطوة خمس مرات.
2. محلل خلية الطرد المركزي عند 21,000 x g و4 °C لمدة 15 دقيقة ومرشح فائق باستخدام نظام فلتر محقن معقم (بحجم مسام 0.2 ميكرومتر).
   ملاحظه: تظهر الحبيبات الخلوية للعينات التي تم تصحيحها بنجاح حدودا شفافة.
3. استخدم نظام تنقية آلي مزود بعمود ألفة قائم على Ni²⁺ بحجم 5 مل لتنقية الجزء RTA المميز من المادة الفائقة E. coli المصفى بالمصفاة المعقمة. بشكل عام، استخدم سرعة إخراج تبلغ 1 مل/دقيقة وتبريد نظام التنقية بالكامل لمنع ارتباط السموم بشكل غير فعال وفقدان نشاط السموم.
   ملاحظه: تم سرد معايير تنقية RTA الفعالة في الجدول 1.
   1. باختصار، قم بتسوية عمود الألفة مع 20 مل من مخزن الربط لإزالة مخزن التخزين. ضع مادة فائقة مفلترة معقمة على عمود الألفة باستخدام حقنة.
   2. اغسل العمود ب 25-35 مل من حاجز الارتباط لإزالة البروتينات غير المرتبطة من العمود. قم بخطوة الغسيل حتى تقترب امتصاصات الأشعة فوق البنفسجية عند 280 نانومتر من القيمة الأولية للأشعة فوق البنفسجية.
   3. جزء RTA مرتبط بالإلوت في 20-35 مل من مخزن التهوية (500 ملليموين إيميدازول، 500 ملليمول NaCl، 20 ملليمولار KH₂PO₄، pH = 7.2) ويحافظ على العينة على التجميد (الشكل 1A والشكل 1B).
      ملاحظه: يتميز تفريغ جزء RTA بزيادة في امتصاص الأشعة فوق البنفسجية. يرجى ملاحظة جمع هذه النسبة حصريا لمنع التلوث بالبروتينات غير المحددة المرتبطة.

الجدول 1: المعاملات المستخدمة لتنقية الألفة القائمة على الأعمدة، وإزالة الملح من الخصائص. قائمة بجميع إعدادات الأعمدة ذات الصلة (مثل معدل التدفق، تركيز مخزن التسهيل، التوازن ومدة خطوات الغسيل) والمعلمات المقاسة (مثل التوصيل أو امتصاص الأشعة فوق البنفسجية).

معامل كروماتوغرافيا الألفة
معايير القياس	الأشعة فوق البنفسجية (280 نانومتر)، تركيز مخزن الاستنطاع، التوصيلية
اعدادات	المتغير/الوحدة	قيمة
معدل التدفق	mL/min	1
أقصى ضغط للعمود	الكروب الذهنيه	0.35
طول الموجة	نانومتر	280 نانومتر
مخزن الربط	موضع المضخة	A
مخزن الاستواء	موضع المضخة	B
مخزن تفريغ التركيز الابتدائي	%	0
تعويض حجم النظام	مل	10
توازن الأعمدة	مل	20
حقن عينة عبر السوبرلوب/الحقنة	مل	حجم محلل الخلايا
خطوة الغسيل	مل	20-35
خطوة التوضيح	مل	20-35
مخزن الترشيح بالتركيز أثناء التسرب	%	100
إعادة معايرة العمود ب 20٪ EtOH	مل	50
معامل إزالة الأملاح
معايير القياس	الأشعة فوق البنفسجية (280 نانومتر)، التوصيلية
اعدادات	المتغير/الوحدة	قيمة
معدل التدفق	mL/min	4
أقصى ضغط للعمود	الكروب الذهنيه	0.35
طول الموجة	نانومتر	280 نانومتر
مخزن الربط	موضع المضخة	A
مخزن الاستواء	موضع المضخة	B
مخزن تفريغ التركيز الابتدائي	%	0
تعويض حجم النظام	مل	10
توازن الأعمدة	مل	20
حقن عينة عبر السوبرلوب/الحقنة	مل	حجم محلل الخلايا
حقن محلول إزالة الملح (0.8 متر سوربيتول)	مل	100
إعادة معايرة العمود ب 20٪ EtOH	مل	50

النتائج

الشكل 1: نتائج الكروماتوغرافيا التمثيلية للتقارب وإزالة الملح لخلايا الإشريكية القولونية التي تحتوي على pET-RTA_(His)6 أو التحكم الناقل الفارغ. (أ) رسم بياني لتنقية نموذجي لعينة ليحفي خ...

المواد