$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. تحضير النانوسيلولوز البكتيري (BNC)
ملاحظه: تجرى جميع الخطوات تحت ظروف معقمة، ما لم يذكر خلاف ذلك.
- وسيط التحضير للزراعة.
- حضر 500 مل من وسط الزراعة السائلة بخلط 25 جرام من مستخلص الخميرة، و15 جرام من البيبتون، و125.0 جرام من المانيتول، و500 مل من الماء عالي النقاية. استخدم هذا الخليط على جهاز تعقيم عند 120 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة وخزن عند 4 درجة مئوية.
- حضر 100 مل من الوسط شبه الصلب بإضافة 15 جرام من الأجار إلى 5.0 جرام من مستخلص الخميرة، و3.0 جرام من البيبتون، و25.0 جرام من المانيتول، و100 مل من الماء عالي النقاء. استخدم هذا الخليط على حرارة 120 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. بعد التداخل داخل الجهاز، ضع 5 مل من الخليط في طبق بترى بلاستيكي بحجم 90 مم × 16 مم. دع المحلول يتجلد عند 4 درجات مئوية وخزن عند هذه الدرجة حتى استخدام آخر.
- أعد ترطيب سلالة جلوكوأسيتوباكتر زيلينوس (G. xylinus) المحفوظة في قوارير مجففة بالتجميد بإضافة 1 مل من وسط الزراعة السائل وإزالة الأنبوبات صعودا وهبوطا، كما هو موضح في تعليمات الشركة المصنعة.
- قم بتلقيح أطباق بتري التي تحتوي على وسط شبه صلب بقطرات صغيرة من تعليق البكتيريا باستخدام حلقة تلقيح. تأكد من أن التلقيح يغطي كامل طبق البتري عن طريق تحريك الحلقة في اتجاه متعرج من الحافة إلى مركز الطبق.
- حضن أطباق بتري على حرارة 26 درجة مئوية لمدة 72 ساعة في حاضنة بدون ثاني أكسيد الكربون. بمجرد اكتمال فترة الحضانة، تظهر مستعمرات بيضاء صغيرة. إذا لم تستخدم المستعمرات فورا، خزن أطباق بتري عند 4 درجات مئوية عن طريق إغلاق الغطاء بفيلم بارا فيلم ووضعها مقلوبة. يمكن تخزين المستعمرات بهذه الطريقة لمدة تصل إلى 6 أشهر.
- انقل 2 مل من وسط الزراعة السائل إلى كل بئر من صفيحة زراعة الأنسجة التي تحتوي على 24 بئرا. خذ مستعمرتين مع إبرة تلقيح من أطباق بتيري المتلقونة وضعهما في البئر الأول من طبق زراعة الأنسجة. كرر نفس الإجراء مع الآبار ال 23 المتبقية.
- حضن لوحة زراعة الأنسجة على حرارة 30 درجة مئوية لمدة 7 أيام. سيؤدي ذلك إلى ما مجموعه 24 قطعة من BNC بقطر 16 مم وسماكة تقريبية بين 2-3 مم، كما هو موضح في الشكل 1. ملاحظه: لا تزعج الزراعة البكتيرية في أي وقت خلال فترة الحضانة، على سبيل المثال، عن طريق هز اللواح. خلال فترة الحضانة، يقوم G. xylinus ببرز جزيئات السكر غلوكبيرانوز لتشكيل شبكة بلورية بوليمرية في واجهة الهواء والسائل، والتي تتبنى شكل وحجم القارورة تحت ظروف الزراعة الثابتة. هذه المصفوفة البوليمرية، المعروفة باسم النانوسلولز البكتيري (BNC)، تكون بارزة في نهاية فترة الحضانة.
- اجمع حبيبات BNC من وسط النمو وتعقيمها في محلول 1٪ NaOH لمدة ساعة واحدة على درجة حرارة 50 درجة مئوية، لإزالة جميع آثار G. xylinus. اختياريا، تحريك هذا المحلول بسرعة 300 دورة في الدقيقة باستخدام قضيب مغناطيسي وطبق تحريك. تخلص من محلول NaOH وأضف 200 مل من محلول NaOH الطازج المحضر 1٪. كرر نفس العملية مرة أخرى أو حتى تكتسب حبيبات BNC في المحلول مظهرا شفافا.
- اشطف حبيبات BNC بالماء ثلاث مرات وخزنها في ماء عالي النقاء في RT. تأكد من أن حبيبات BNC مغمورة بالكامل في الماء ولا تسمح لها بالجفاف في أي وقت.
- استخدم معقم الحبيبات BNC عند 121 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. ملاحظة: دراسة تحت الجلد في الجسم الحي على الفأر أجراها مارتسون وزملاؤه لم تظهر أي علامات تدهور لسرطان BNC بعد 60 أسبوعا من الانغراس. في الواقع، فإن BNC قابل للتحلل بطبيعته بواسطة الإنزيمات الميكروبية والفطرية، والتي لا توجد في الثدييات. من ناحية أخرى، يمكن أن يكون التحلل الحيوي لل BNC نتيجة عمليات ميكانيكية وكيميائية وبيولوجية تضعف شبكة الألياف الدقيقة في الجسم الحي.
