عزل الأبواغ الداخلية من عينة بيئية عن طريق التحلل المستهدف للخلايا النباتية

الملخص

المصدر: وندرلين، ت.، وآخرون. العزل الفيزيائي للأبواغ الداخلية عن العينات البيئية من خلال التحلل المستهدف للخلايا النباتية. J. Vis. Exp. (2016)

يوضح هذا الفيديو طريقة لعزل الأبواغ الداخلية من عينة بيئية تحتوي على خلايا نباتية وبكتيريا مختلفة. تتضمن العملية الترشيح، والاضطراب الميكانيكي، والمعالجة الكيميائية الانتقائية لإضعاف وتحليل الخلايا النباتية مع الحفاظ على الأبواغ الداخلية. الخطوة الأخيرة تعزل الأبواغ الداخلية المرنة من خلال ترشيح الغشاء.

البروتوكول

1. تحضير المواد الكيميائية والمعدات

1. اصنع 500 مل من محلول 1٪ من سداسي ميتافوسفات الصوديوم (SHMP) (NaPO₃)_n وتعقيم عن طريق التعقيم (autoclaving).

2. تعقيم مرشحات النيتروسليلوز (NC) (حجم المسامات 0.22 ميكرومتر، القطر 47 مم) عن طريق التداخل داخل أطباق بتري الزجاجية المغلقة.

3. تعقيم مرشحات NC (حجم المسامات 0.22 ميكرومتر، قطر 25 مم) عن طريق التعقيم في أطباق بتري الزجاجية المغلقة.

4. وزن وملاحظة الوزن الفارغ لأنابيب المعقمة 50 مل (مع غطاء) (أنبوب واحد لكل عينة).

5. تحضير مخزن Tris-EDTA (مخزن TE) 1x: اصنع محلول من 10 ملليموتر تريس (تريس(هيدروكسي ميثيل)أمينوميثان) و1 ململ من مخزن EDTA. اضبط درجة الحموضة إلى 8 وقم بتعقيم الوضع بالأوتوكلاف.

6. تحضير محلول الليزوزيم (20 ملغ/مل) عن طريق إذابة 0.02 جرام من الليزوزيم في 1 مل من مخزن TE. من الأفضل أن تجعله جديدا في كل مرة. خزن على حرارة 4 درجات مئوية لمدة لا تزيد عن أسبوع واحد.

7. تحضير محلول فسيولوجي عن طريق إذابة 8 جرام/لتر كلوريد الصوديوم (NaCl) في ماء مقطر. قم بالتعقيم عن طريق التعقيم (autoclaving).

2. فصل الكتلة الحيوية عن الرواسب

1. أضف 3 جرام من عينة الرواسب إلى أنابيب معقمة وزنت مسبقا بحجم 50 مل باستخدام مجارف معدنية مشتعلة بالإيثانول. قم بذلك في خزانة سلامة حيوية نظيفة ومعقمة بالأشعة فوق البنفسجية لتجنب التلوث.

2. أضف 15 مل من محلول SHMP معقم بنسبة 1٪ (معقم التعيين) إلى العينة باستخدام بوريت معقم متدرج. يمكن أيضا ترشيح محلول SHMB لتجنب التلوث.

3. توحيد الرواسب ومحلول SHMP باستخدام موزع سائل/متجانس (مثل Ultra-Turrax homogenizer). تعقم أو تعقيم دوار التشتت بالإيثانول بنسبة 70٪ قبل الاستخدام. شغل التجانس لمدة دقيقة واحدة عند 17,500 دورة في الدقيقة. دع العينة ترتاح لمدة دقيقتين وكرر التجانس لمدة دقيقة واحدة بنفس سرعة الدوار.

4. اترك العينة واقفة لمدة 10 دقائق. في هذه الخطوة، ستترسب أثقل الجسيمات (المعادن). ومع ذلك، ستبقى الخلايا وأي مكونات عضوية في العينة في المحلول. بعد ذلك، نقل المحلول الفائق (الذي يحتوي على الكتلة الحيوية للخلية) إلى أنبوب نظيف بحجم 50 مل، مع الانتباه لعدم إزعاج حبيبات الرواسب.

5. أضف مرة أخرى 15 مل من محلول SHMP معقم بنسبة 1٪ (معقم للعمل) إلى حبيبات الرواسب باستخدام بوريت معقم متدرج ومعقم. ثم كرر الخطوات 2.3 و2.4. يضمن هذا التكرار فصل أكبر عدد من الخلايا والجزيئات العضوية عن المكون المعدني في الرواسب. يمكن دمج الفائق لهذا الانفصال الثاني مع الفائق من الانفصال الأول.

ملاحظه: تتم الخطوات التالية كلها على المادة الفائقة (التي تحتوي على الكتلة الحيوية للخلية). يمكن التخلص من المكون المعدني (حبيبات الرواسب).

6. قم بطرد مركزي للعينة بقوة 20 x g لمدة دقيقة واحدة. تزيد هذه الخطوة من قوة الجاذبية بما يكفي لترسيب جزيئات المعادن الصغيرة بينما تبقى المادة البيولوجية في المحلول. بعد الطرد المركزي، انقل المحلول الفائق (الذي يحتوي على الكتلة الحيوية للخلية) إلى أنبوب نظيف بحجم 50 مل. تخلص من الحبيبات المعدنية.

7. تحديد الحجم النهائي للمحلول الذي يحتوي على الكتلة الحيوية عن طريق وزن العينة. تحديد الوزن يتجنب نقل العينة إلى أسطوانة متدرجة ويقلل من خطر التلوث.

3. جمع الكتلة الحيوية على غشاء المرشح

1. جهز وحدة ترشيح (لأغشية قطرها 47 مم) ومضخة تفريغ. قم بتعقيم وحدة الترشيح إما عن طريق الأوتوكلاف أو (إذا كان زجاج بايركس) برش 70٪ إيثانول وحرقها بموقد بنسن. دع الأمور تبرد قبل أن أكمل البروتوكول.

2. إضافة غشاء NC معقم إلى وحدة الترشيح باستخدام ملقط معقم مشتعل بالإيثانول.

3. أضف نصف عينة الفائق (من الخطوة 2.6) إلى وحدة الترشيح الغشائية وجمع الخلايا من الغشاء باستخدام مضخة التفريغ.

4. عندما يمر السائل بالكامل عبر الفلتر، أوقف مضخة التفريغ وانزع الغشاء بعناية باستخدام ملقط معقم باللهب بالإيثانول. ضع الغشاء في طبق بتري معقم.

1. اقطع الغشاء إلى نصفين باستخدام مقص معقم مشتعل باللهب بالإيثانول. أضف كل نصف من الغشاء إلى أنبوب منفصل بحجم 2 مل. سيتم استخدام نصف الغشاء لاستخراج وتحليل الحمض النووي لمجتمع البكتيريا بأكمله. أما النصف الآخر من الفلتر تخزينه عند -80 درجة مئوية ويعمل كاحتياطي.

5. ضع غشاء NC جديد على وحدة الترشيح وجمع الكتلة الحيوية من النصف الثاني من حجم العينة (من الخطوة 2.6) باستخدام مضخة التفريغ.

6. عندما يمر السائل بالكامل عبر الفلتر، أوقف مضخة التفريغ وقم بإزالة الغشاء بعناية باستخدام ملقط معقم ومشعل باللهب بالإيثانول. ضع الغشاء بالكامل في أنبوب منفصل بحجم 2 مل. ستستخدم هذه العينة في العلاج لفصل الأبواغ الداخلية عن الخلايا النباتية. يمكن تخزين العينة عند -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.

4. تحلل الخلايا النباتية

1. إجراء العلاج لفصل الأبواغ الداخلية عن الخلايا النباتية على الكتلة الحيوية التي جمعت سابقا على غشاء NC (الخطوة 3.6).

1. إذا كان الغشاء متجمدا، اتركه على RT لمدة 10 دقائق ليذوب. ثم ضع الغشاء في طبق بتري معقم وقطعه (حوالي 4 مرات) إلى قطع أصغر باستخدام مقص معقم مشتعل باللهب بالإيثانول. ثم ضع جميع قطع الفلتر الغشائي في أنبوب معقم بحجم 2 مل.

2. أضف 900 ميكرولتر من 1x TE (Tris-EDTA) (انظر 1.5) إلى الأنبوب الذي يحتوي على غشاء العينة وامزج جيدا عن طريق دوامة. في هذه الخطوة، يتم إزالة الكتلة الحيوية من الغشاء إلى محلول TE-buffer.

3. ضع الأنبوب في الحاضنة عند 65 درجة مئوية لمدة 10 دقائق و80 دورة في الدقيقة. بعد ذلك، أخرج الأنبوب من الحاضنة واتركه يبرد لمدة 15 دقيقة.

4. أضف 100 ميكرولتر من الليزوزيم الطازج (انظر 1.5) للوصول إلى تركيز نهائي يبلغ 2 ملغ/مل. لا تضيف الليزوزيم قبل أن تبرد العينة إلى 37 درجة مئوية، لأن ذلك قد يؤدي إلى تحلل الإنزيم.

5. حضانة العينة عند 37 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة و80 دورة في الدقيقة، وهي الظروف المثلى لتحليل الخلايا النباتية بواسطة الليزوزيم.

6. بعد اكتمال التحلل، أضف 250 ميكرولتر من 3 نيتروفن هيدروكسيد الصوديوم (NaOH) و250 ميكرولتر من محلول كبريتات الصوديوم الدودسيل 6٪ (SDS) إلى العينة. بإضافة ذلك، يصل حجم العينة إلى 1.5 مل، ويكون تركيز نهائي 0.5 نيتروتن NaOH وتركيز نهائي 1٪ SDS.

7. احتضن هذا المزيج على RT لمدة 60 دقيقة و80 دورة في الدقيقة. إضافة القاعدة والمغسلات سيساعد في تحلل الخلية النهائي. تم تحسين تركيز هذه المنظفات حتى لا تضر الأبواغ أثناء تحلل الخلايا النباتية.

8. جهز وحدة ترشيح معقمة تحمل أغشية قطرها 25 مم عن طريق التعقيم أو (إذا كان زجاج بايركس) برش 70٪ إيثانول وإشعالها بموقد بنسن. دعها تبرد.

9. ضع غشاء NC بقطر 0.2 ميكرومتر (قطر 25 مم) على وحدة الترشيح باستخدام ملقط معقم باللهب الإيثانولي.

10. أضف العينة من الخطوة 4.7 إلى الغشاء وقم بترشيح السائل باستخدام مضخة التفريغ. عندما يمر السائل، قم بإيقاف مضخة التفريغ. في هذه الخطوة، تزال المادة النباتية المتحللة لأنها لا تحتجز على الغشاء. فقط الأبواغ الداخلية ستبقى على الغشاء.

11. أضف 2 مل من المحلول الفسيولوجي المعقم لغسل المنظفات المتبقية وتصفية السائل باستخدام مضخة التفريغ.

12. عندما يكون السائل قد تصفي بالكامل، قم بإيقاف تشغيل مضخة التفريغ. اترك الغشاء على وحدة الترشيح.

المواد