انسداد التكاثر المضبط الموسوم بالفلورية في الإشريكية القولونية

الملخص

المصدر: ميتريك، ك. أ.، لورانس، وآخرون، تحفيز انسداد تكرار محدد الموقع في الإشريكية القولونية باستخدام نظام مشغل كبح فلوري. J. Vis. Exp. (2016)

يظهر هذا الفيديو انسداد شوكة النسخ الخاصة بالموقع في الإشريكية القولونية باستخدام التعبير الناتج عن الأرابينوز لمادة TetR الفلورية الأصفر الموسومة التي ترتبط بمصفوفات التيتو الكروموسوماتية.

البروتوكول

1. حجب التكرار باستخدام نظام مشغل مثبط الفلورة (FROS)

1. تحفيز انسداد التكرار
   1. تخفيف مزرعة طازجة لسلالة الإشريكية القولونية الطازجة التي تحمل مصفوفة تيتو وpKM118 إلى OD₆₀₀نانومتر = 0.01 في وسط مركب مخفف (0.1٪ تريبتون، 0.05٪ مستخلص خميرة، 0.1٪ NaCl، 0.17 M KH₂PO₄، 0.72 M K₂HPO₄) مع المضادات الحيوية اللازمة للاختيار.
      ملاحظه: لا تضيف التتراسيكلين للاختيار لأنه غير متوافق مع هذا النظام. اجعل حجم الزراعة يعادل 10 مل لكل عينة مطلوبة. على سبيل المثال، حجم الزراعة لتصميم التجربة في الشكل 1 هو 60 مل.
   2. انمو عند 30 درجة مئوية مع الرج حتى درجة الحرارة₆₀₀ نانومتر = 0.05-0.1. إزالة عينة بحجم 10 مل لتكون الضابط غير المحرض وأضف 0.1٪ أرابينوز إلى الثقافة المتبقية لتحفيز إنتاج TetR-YFP من pKM1. استمر في زراعة كل من الزراعة غير المستحثة والمحفزة. بعد ساعة واحدة، تحقق من وجود نقطة تركيز واحدة داخل كل خلية من الزراعة المستحثة باستخدام المجهر الفلوري.
   3. إذا تم تأكيد حجب الخلايا المستحثة (أكثر من 70٪ من الخلايا لها تركيز واحد)، سجل OD_{بطول 600}نانومتر وخذ عينة بحجم 7.5 مل للتحليل بواسطة هلام ثنائي الأبعاد. خذ عينة مكافئة من الثقافة الضابطة غير المتحفزة.

النتائج

الشكل 1: نظرة عامة على إجراء التجربة لتكاثر كتلة وتحرير FROS. تزرع سلالات الإشريكية القولونية التي تحمل مصفوفة التيتو عند درجة حرارة 30 درجة مئوية. عندما تصل الخلايا إلى OD₆₀₀نانومتر فوق 0.05، يتم تحفيز إنتاج TetR-YFP باستخد...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
التريبتون	سيغما-ألدرتش	16922	مكون وسائط النمو
كلوريد الصوديوم	VWR	27810.364	مكون وسائط النمو
مستخلص الخميرة	سيغما-ألدرتش	92144	مكون وسائط النمو
فوسفات البوتاسيوم أحادي الأساس	سيغما-ألدرتش	P9791	مكون وسائط النمو؛ مكون مخزن البوتاسيوم
فوسفات البوتاسيوم ثنائي القاعدي	سيغما-ألدرتش	P3786	مكون وسائط النمو؛ مكون مخزن البوتاسيوم
إل-أرابينوز	سيغما-ألدرتش	A3256	لإدخال إنتاج TetR-YFP
مجهر أكسيوسكوب 2 الفلوري	زييس	452310	تصور الخلايا
مجموعة مرشحات eYFP	تقنية كروما	41028	تصور YFP
كاميرا CCD	هاماماتسو	أوركا-إيه جي	تصور الخلايا
برنامج ميتامورف (الأجهزة الجزيئية)	SDR العلمي	31282	الإصدار 7.8.0.0 المستخدم في إعداد هذه المخطوطة