مقالة منهجية

التضخيم الإيزوثيرامي الوسيط بالحلقة لاكتشاف جينات البكتيريا

نوفمبر 28, 2025

في هذه المقالة

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المصدر: دومسل، ك. ج. وآخرون. تضخيم إيزوثيرمالي بالحلقات لفحص السالمونيلا في الغذاء الحيواني وتأكيد السالمونيلا من العزل الزرعي. J. Vis. Exp. (2020).

يوضح هذا الفيديو تقنية التضخيم المتساوي الحراري الوسيطة بالحلقة (LAMP) لاكتشاف جين بكتيريا مستهدفا عن طريق تضخيم الحمض النووي عند درجة حرارة ثابتة. يتم تحضير خليط التفاعل بإضافة خليط رئيسي متساوي الحرارة، وبادئات محددة للجين المستهدف، وعينات تحتوي على قوالب DNA. يبدأ التضخيم باستخدام جهاز LAM، ويتم مراقبة الفلورة في الوقت الحقيقي لتأكيد وجود الجين المستهدف.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ملاحظة: مزيج تفاعل التضخيم المتساوي الحراري (LAMP) الوسيط بالحلقة يحتوي على بوليميراز DNA، وبامز، وكبريتات المغنيسيوم (MgSO4)، وثلاثيات الفوسفات ذات النيوكسينيوكليوتيد (dNTPs)، وبادئات، وقالب DNA، وماء. أول أربعة كواشف تحتوي على خليط رئيسي متساوي الحرارة (جدول المواد). يتم خلط البرايمرات مسبقا داخليا لتصبح خليط برايمر (10x). يمكن تحضير قوالب الحمض النووي من مرق تخصيب عينات غذاء حيوانية لأغراض الفحص أو من مزارع عزلات سالمونيلا مفترضة لأغراض التأكيد. بالإضافة إلى ذلك، يتم تضمين ضابط إيجابي (حمض نووي مستخرج من أي سلالات مرجعية للسالمونيلا ، مثل سالمونيلا أنتيريكا سيروفار Typhimurium ATCC 19585 [LT2]) وضابط بدون قالب (NTC؛ ماء جزيئي معقم) في كل تشغيل LAMP (اختبار LAMP الطبيعي).

1. تحضير قوالب الحمض النووي

  1. لتحضير قوالب الحمض النووي من إثراء الأغذية الحيوانية، اتبع هذه الخطوات.
    1. يتم وزن 25 جراما من عينة طعام معقم (مثل طعام القطط الجاف، طعام الجاف، علف الماشية، علف الخيول، علف الدواجن، وعلف الخنازير) في كيس فلتر معقم (جدول المواد)، أو ما يعادله. ضع الكيس في وعاء أو رف كبير للدعم أثناء الحضانة.
    2. أضف 225 مل من ماء البيبتون المعقم المعقم (BPW). اخلط جيدا عن طريق التدوير وتدليك اليد لفترة قصيرة. اتركها على درجة حرارة الغرفة لمدة 60 ± 5 دقائق.
    3. اخلط جيدا عن طريق التدوير وحدد درجة الحموضة باستخدام ورقة اختبار. اضبط الرقم الهيدروجيني إذا لزم الأمر إلى 6.8 ± 0.2 مع هيدروكسيد الصوديوم المعقم 1 نيتروجين (NaOH) أو حمض الهيدروكلوريك (HCl) المعقم. حضن عند 35 ± 2 درجة مئوية لمدة 24 ± 2 ساعة.
    4. اخلط جيدا عن طريق تدوير الكيس الذي يحتوي على مرق إثراء الطعام الحيواني. انقل 1 مل من الجانب المفلتر للكيس إلى أنبوب طرد مركزي دقيق. دوامة لفترة وجيزة.
    5. استخلاص الحمض النووي باستخدام كاشف تحضير العينة (جدول المواد) كما يلي.
      1. الطرد المركزي عند 900 × جرام لمدة دقيقة واحدة لإزالة الجسيمات الكبيرة ونقل المادة الفائقة إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق الجديد.
      2. الطرد المركزي عند 16,000 × g لمدة دقيقتين ثم تخلص من السوبرناتانت.
      3. الحبيبة في 100 ميكرولتر من مادة تحضير العينة وسخنها على حرارة 100 ± 1 درجة مئوية لمدة 10 دقائق في كتلة حرارة جافة.
      4. تبريد إلى درجة حرارة الغرفة وتخزين عينات الحمض النووي عند -20 درجة مئوية.
  2. لتحضير قوالب الحمض النووي من مزارع السالمونيلا المفترضة، اتبع هذه الخطوات.
    1. احصل على عزلات السالمونيلا المفترضة من العزل في جميع الأطعمة وفقا لفصل 5 من BAM الصادر عن إدارة الغذاء والدواء ، القسم د: عزل السالمونيلا.
    2. قم بتلقيح العزلات المفترضة للسالمونيلا على طبق غير انتقائي (مثل الأجار الدموي، الأجار المغذي، وأجار الصويا التريبتيكاز) واحتضن عند 35 ± 2 درجة مئوية لمدة 24 ± 2 ساعة.
    3. انقل عدة مستعمرات منفردة إلى 5 مل من مرق الصويا التريبتيكاز (TSB) أو مرق حقن القلب الدماغي (BHI) وحضن على حرارة 35 ± 2 درجة مئوية لمدة 16 ± ساعتين.
      ملاحظة: يمكن أن تكون هذه الخطوة اختيارية إذا كانت مزرعة السالمونيلا المفترضة نقية. في هذه الحالة، يمكن إعداد قوالب DNA عن طريق تعليق عدة مستعمرات منفردة في 5 مل من TSB وتسخين 500 ميكرولتر من التعليق عند 100 ± 1 درجة مئوية لمدة 10 دقائق في كتلة حرارة جافة. تابع الخطوة 5 أدناه.
    4. انقل 500 ميكرولتر من الزراعة الليلة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق وسخن على حرارة 100 ± 1 درجة مئوية لمدة 10 دقائق في كتلة حرارة جافة.
    5. تبريد إلى درجة حرارة الغرفة وتخزين مستخلصات الحمض النووي المعزولة عند -20 درجة مئوية.
  3. لتحضير حمض نووي مثبت للتحكم الإيجابي، اتبع خطوات مشابهة لإعداد قوالب الحمض النووي من مزارع السالمونيلا المفترضة مع خطوة تخفيف إضافية.
    1. تلقيح S. Typhimurium ATCC 19585 (LT2) أو أي سلالات مرجعية للسالمونيلا على صفيحة أجار غير انتقائية (مثل الأجار الدموي، الأجار المغذي، وأجار الصويا التريبتيكاز) وحضن عند 35 ± 2 درجة مئوية لمدة 24 ± 2 ساعة.
    2. انقل عدة مستعمرات منفردة إلى 5 مل من مرق TSB أو BHI وحضن عند 35 ± 2 درجة مئوية لمدة 16 ± 2 ساعة لتصل إلى ~109 CFU/mL.
    3. قم بتخفيف الزراعة الليلا بشكل تسلسلي في ماء ببتون بنسبة 0.1٪ للحصول على ~107 وحدة CFU/مل.
    4. انقل 500 ميكرولتر من هذا التخفيف إلى أنبوب جهاز الطرد المركزي الدقيق وسخنه عند 100 ± 1 درجة مئوية لمدة 10 دقائق في كتلة حرارية جافة.
    5. تبريد إلى درجة حرارة الغرفة وتخزن الحمض النووي المثبت للتحكم عند -20 درجة مئوية.

2. تحضير خليط البرايمر (10x)

  1. احصل على بادئات LAMP المصنعة تجاريا (Sal4-F3، Sal4-B3، Sal4-FIP، Sal4-BIP، Sal4-LF، و Sal4-LB) مع تنقية إزالة الأملاح القياسية (الجدول 1). تحضير محاليل المخزون لكل برايمر (100 ميكرومتر) عن طريق إعادة ترطيب البرايمر بكمية مناسبة من الماء الجزيئي المعقم. اخلط جيدا عن طريق الدوامة لمدة 10 ثوان وخزن عند -20 درجة مئوية (-80 درجة مئوية للتخزين طويل الأمد).
  2. حضر خليط البرايمر (10 مرات) وفقا لورقة عمل (الجدول 2). أضف كميات مناسبة من محاليل مخزون البرايمر ومياه جزيئية معقمة في أنبوب الطرد المركزي الدقيق. اخلط جميع المواد الكيميائية جيدا عن طريق الدوامة لمدة 10 ثوان. أليكوت خليط البرايمر 10x إلى 500 ميكرولتر لكل أنبوب طرد مركزي دقيق وخزنها عند -20 درجة مئوية.

3. تجميع تفاعل LAMP

ملاحظة: لمنع التلوث المتبادل، ينصح بشدة بفصل المناطق المستخدمة فعليا لتحضير خليط LAMP الرئيسي وإضافة قوالب الحمض النووي. الشكل 1 هو مخطط لمبة.

  1. التحضير وإعداد الجولة
    1. طاولة نظيفة مع الأيزوبروبانول ومحلول متحلل للحمض النووي وDNase (جدول المواد). نظف الماصات وحوامل شرائط الأنابيب (جدول المواد) باستخدام محلول تحلل الحمض النووي وDNase.
    2. قم بإذابة خليط الماستر إيزوثيرمال، وخليط البرايمر (10x)، والماء الجزيئي، والحمض النووي للتحكم الإيجابي، وقوالب الحمض النووي في درجة حرارة الغرفة.
    3. شغل أداة LAMP (جدول المواد) واضغط على شاشة الفتح للوصول إلى الشاشة الرئيسية. اتبع هذه الخطوات لإنشاء جولة.
      ملاحظة: يحتوي نموذج واحد من جهاز LAMP على كتلتين (A و B) مع 8 عينات في كل كتلة، ونموذج آخر يحتوي على كتلة واحدة تستوعب 8 عينات (جدول المواد).
      1. اضغط على LAMP+Anneal واختر تعديل لإدخال معلومات العينة.
        ملاحظة: يتكون ملف تشغيل LAMP الافتراضي من تضخيم عند 65 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة وطور تخريجي من 98 درجة مئوية إلى 80 درجة مئوية مع انخفاض قدره 0.05 درجة مئوية في الثانية.
      2. انقر على كل صف عينة لتفعيل المؤشر وإدخال معلومات العينة ذات الصلة، باستخدام أيقونة كتلة AB للتبديل بين كتلتي LAMP للجهاز.
      3. اضغط على أيقونة التحقق عندما يتم إدخال جميع معلومات العتبة.
        ملاحظة: اختياريا، يمكن حفظ إعداد السلسلة (المسمى "الملف الشخصي"، والذي يحتوي على معلومات عينة مع ملف تعريف تشغيل LAMP الافتراضي) للاستخدام لاحقا. اضغط على أيقونة الحفظ وامنح الملف اسما فريدا. عند اختبار نفس مجموعة العينات في المرة القادمة، يمكن بدء تشغيل جديد باستخدام ملف الملف المحفوظ (الملف الشخصي). اضغط على أيقونة المجلد في أسفل يسار الشاشة الرئيسية واختر ملف تعريف لتحميل الملفات المحفوظة.
  2. تجميع تفاعل LAMP
    ملاحظة: عند استخدام كلتا الكتلين من آلات LAMP (A و B، بإجمالي 16 عينة)، جهز مزيج LAMP الرئيسي ل 18 عينة. إذا استخدمت كتلة واحدة فقط من آلات LAMP (8 عينات إجمالا)، جهز خليط LAMP الرئيسي ل 10 عينات. بالنسبة لأرقام عينات أخرى، قم بضبط الحجم وفقا لتناسب فقدان التوصيل بالمصدر. دائما أضف جهاز تحكم إيجابي وجهاز NTC في كل تشغيل LAMP (LAMP للعمل). يوصى بإجراء اختبار تكراري لكل عينة في عمليات LAMP المستقلة.
    1. حضر خليط LAMP الرئيسي وفقا لورقة عمل (الجدول 3). أضف كميات مناسبة من خليط الماستر إيزوثيرمال، وخليط البرايمر، والماء الجزيئي في أنبوب ودوامة دقيقة بلطف لمدة 3 ثوان. الطرد المركزي لفترة وجيزة.
    2. ضع شريط الأنبوب في حامل الشريط ووزع 23 ميكرولتر من خليط LAMP الرئيسي على كل بئر.
    3. قم بتدوير جميع قوالب الحمض النووي والطرد المركزي لفترة وجيزة. أضف 2 ميكرولتر من قالب الحمض النووي إلى البئر المناسب وأغلقه بإحكام.
    4. قم بإزالة شريط الأنبوب من الحامل وحرك المعصم للتأكد من تجمع جميع المواد في أسفل الأنبوب.
    5. قم بتحميل شريط الأنبوب في كتلة أدوات LAMP (أو بلوكات) الجهاز، مع التأكد من تثبيت الأغطية قبل إغلاق الغطاء.

4. جولة المصباح

ملاحظة: أثناء تشغيل LAMP يتم التقاط قراءات الفلورة باستخدام قناة FAM. يتم تحديد قيم الوقت إلى الذروة (Tmax؛ الحد الأدنى) تلقائيا بواسطة الجهاز للنقطة الزمنية التي تصل فيها نسبة الفلورة إلى القيمة القصوى لمنحنى معدل التضخيم. درجة حرارة Tm (°C) هي درجة حرارة الذوبان/التلدين للمنتج النهائي المضخم.

  1. انقر على أيقونة الجري في أعلى يمين الشاشة واختر الكتلة التي تحتوي على شرائط الأنابيب لبدء تشغيل LAMP التشغيلي.
  2. اختياريا، أثناء سير التفاعل، اضغط على علامات التبويب Temperature وAmplification وAnneal لرؤية التغيرات الديناميكية في مختلف المعلمات أثناء تشغيل LAMP (LAMP التشغيل).
  3. بمجرد اكتمال التشغيل، اضغط على علامات التبويب Amplification وAnneal لرؤية التضخيم الكامل ومنحنيات Aneal، ثم اضغط على تبويب النتائج لعرض النتائج.
  4. اختياريا، لحفظ السجلات، يتم تسجيل رقم الجولة الموجود في أعلى يسار الشاشة، باستخدام صيغة "رقم number_run تسلسلي للآلة"، مثل "GEN2-2209_0030."

الجدول 1: مقدمات LAMP لفحص السالمونيلا في الطعام الحيواني وتأكيد السالمونيلا من عزل الزرعة. تم تصميم البادئات بناء على تسلسل السالمونيلا invA (رقم وصول GenBank M90846).

اسم البدايةوصفالتسلسل (5'-3')الطول (bp)
سال4-إف 3الأساس الخارجي الأماميGAACGTGTCGCGGAAGTC18
سال4-ب3الأساس الخارجي العكسيCGGCAATAGCGTCACCTT18
Sal4-FIPالأساس الداخلي الأماميGCGCGGCATCCGCATCAATA-TCTGGATGATGCCCGG38
Sal4-BIPالأساس الداخلي العكسيGCGAACGGCGAAGCGTACTG-TCGCACCGTCAAAGGAAC38
Sal4-LFتمهيد الحلقة الأماميTCAAATCGGCATCAATACTCA-TCTG25
سال4-LBالأساس العكسي الحلقيAAAGGGAAAGCCAGCTTTACG21

الجدول 2: ورقة عمل لتحضير خليط البرايمر الخاص ب LAMP (10x). المبادئ المدرجية مدرجة في الجدول 1.

مكونالمخزون (μM)خليط التمهيد (ميكرومتر)الحجم (μL)
برايمر Sal4-F3100110
برايمر Sal4-B3100110
برايمر Sal4-FIP10018180
برايمر Sal4-BIP10018180
برايمر Sal4-LF10010100
برايمر Sal4-LB10010100
الماء الجزيئيلا يوجدلا يوجد420
مجموعلا يوجدلا يوجد1000

الجدول 3: ورقة عمل لتحضير خليط تفاعل LAMP الخاص بها. يتم تحضير خليط البرايمر (10x) وفقا للجدول 2 باستخدام محاليل مخزون من البرايمرات المدرجة في الجدول 1.

مكونالعمل بشكل قاطع.رد الفعل النهائي: الخلاصة.الحجم لكل عينة (μL)حجم 18 عينة (μL)حجم 10 عينات (ميكرولتر)
خليط رئيسي متساوي الحرارة ISO-0011.67x1x15270150
خليط البرايمر10 مرات1x2.54525
المياه الجزيئية الدرجةلا يوجدلا يوجد5.59955
المجموع الفرعي لمزيج الماسترلا يوجدلا يوجد23414230
قالب الحمض النوويلا يوجدلا يوجد2لا يوجدلا يوجد

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
24251_Figure_1.jpg

الشكل 1: مخطط تخطيطي لسير عمل Salmonella LAMP

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
مرق حقن القلب في الدماغ (BHI)أنظمة تشخيص BD، سباركس، ماريلاند299070وسط نمو سائل يستخدم في زراعة السالمونيلا.
ماء البيبتون المخزن (BPW)أنظمة تشخيص BD، سباركس، ماريلاند218105وسط تخصيب مسبقي لاستعادة السالمونيلا من عينات غذاء حيوانية.
الحمض النووي خارجثيرمو فيشر ساينتفيك، والثام، ماساتشوستس7010يلغي الحمض النووي غير المرغوب فيه وإنزيمات DNase من مقاعد المختبر، وأدوات الزجاج، والبلاستيك دون التأثير على عينات الحمض النووي اللاحقة.
برنامج جيني إكسبلوررشركة أوبتيجين المحدودة، ويست ساسكس، المملكة المتحدةالإصدار 2.0.6.3يدعم التشغيل عن بعد لأجهزة جيني بما في ذلك تشغيل LAMP وتحليل البيانات.
الجني II أو الجني الثالث (آلة LAMPشركة أوبتيجين المحدودة، ويست ساسكس، المملكة المتحدةالجيل الثاني أو الجيل الثالث أو الثانيجهاز صغير قادر على التحكم في درجة الحرارة حتى 100 درجة مئوية بدقة ± 0.1 درجة مئوية وكشف الفلورة في نفس الوقت عبر قناة FAM. الجني الثاني يحتوي على كتلتين (A و B) مع 8 عينات في كل كتلة. جيني III يحتوي على كتلة واحدة تستوعب 8 عينات.
شريط الجنيشركة أوبتيجين المحدودة، ويست ساسكس، المملكة المتحدةOP-0008شرائط ميكروتيوب ذات 8 آبار مع أغطية قفل مدمجة وحجم عمل يتراوح بين 10 إلى 150 ميكرولتر.
حامل شريط الجنيشركة أوبتيجين المحدودة، ويست ساسكس، المملكة المتحدةGBLOCKيستخدم لتثبيت شرائط الجني عند إعداد تفاعل LAMP أيضا، ويمكن استخدام حامل الألمنيوم أيضا ككتلة تبريد.
محلول حمض الهيدروكلوريك (HCl)، 1 نينوتر.ثيرمو فيشر ساينتفيك، والثام، ماساتشوستسSA48-500يضبط درجة الحموضة لعينات طعام بعد إضافة BPW وقبل الإثراء الليلي.
كتلة الحرارةثيرمو فيشر ساينتفيك، والثام، ماساتشوستس88-860-022يسخن العينات عند 100 ± 1 درجة مئوية لاستخراج الحمض النووي.
حاضنهثيرمو فيشر ساينتفيك، والثام، ماساتشوستس3960حاضنة مختبرية قياسية.
خليط رئيسي متساوي الحرارة ISO-001شركة أوبتيجين المحدودة، ويست ساسكس، المملكة المتحدةISO-001مزيج رئيسي محسن لتبسيط تجميع تفاعل LAM، يحتوي على جزء كبير من بوليميراز DNA GspSSD من نوع Geobacillus spp.، وفوسفاتاز غير عضوي مستقر حراريا، ومخزن تفاعل، وMgSO₄، وdNTPs، وصبغة ربط DNA مزدوجة السلسلة (قناة كشف FAM).
إيزوبوبانولثيرمو فيشر ساينتفيك، والثام، ماساتشوستسA416يعقم أسطح العمل.
برايمرات LAMPشركة إندجنتد دي إن إي إي تكنولوجيز إنك، كورالفيل، آيواتقليدتمهيدات LAMP مع معلومات مفصلة في الجدول 1.
الطرد المركزي الدقيقإبندورف أمريكا الشمالية، هاوبوغ، نيويورك22620207MiniSpin بالإضافة إلى جهاز الطرد المركزي الدقيق الشخصي.
أنابيب الطرد المركزي الدقيقثيرمو فيشر ساينتفيك، والثام، ماساتشوستس05-408-129أنابيب الطرد المركزي الدقيق القياسية.
الماء الجزيئيثيرمو فيشر ساينتفيك، والثام، ماساتشوستسAM9938يستخدم في صنع مخازن البرايمر، وخليط البرايمر، وخليط تفاعل LAMP التفاعلي.
محلول هيدروكسيد الصوديوم (NaOH)، 1 نيوتروفنثيرمو فيشر ساينتفيك، والثام، ماساتشوستسSS266-1يضبط درجة الحموضة لعينات طعام بعد إضافة BPW وقبل الإثراء الليلي.
الأجار غير الانتقائي (مثل الأجار الدموي، الأجار المغذي، وأجار الصويا التريبتيكاز)ثيرمو فيشر ساينتفيك، والثام، ماساتشوستسR01202وسط نمو صلب يستخدم في زراعة السالمونيلا.
ماء بيبتونأنظمة تشخيص BD، سباركس، ماريلاند218071يخفف زراعة السالمونيلا بين ليلة وضحاها لصنع حمض نووي إيجابي للتحكم الطبيعي.
الماصي والنصائحشركة ميتلر-توليدو راينين ذ.م.م، أوكلاند، كاليفورنياسلسلة Pipet Lite LTSماصات وماصات مختبر قياسية.
كاشف تحضير عينات PrepMan Ultraثيرمو فيشر ساينتفيك، والثام، ماساتشوستس4318930مجموعة بسيطة تستخدم لتحضير قوالب الحمض النووي بسرعة لاستخدامها في تفاعل LAMP (تفاعل LAMP السريع).
السلالة المرجعية للسالمونيلا LT2ATCC، ماناساس، فيرجينيا700720السلالة المرجعية للسالمونيلا تستخدم كوسيلة تحكم إيجابية.
مرق الصويا التريبتيكاز (TSB)أنظمة تشخيص BD، سباركس، ماريلاند211768وسط نمو سائل يستخدم في زراعة السالمونيلا.
خلاط الدوامةشركة ساينتيفيك إندستريز، بوهيميا، نيويوركSI-0236خلاط دوامة مختبر قياسي.
كيس فلتر ويرل-باكعلامة ناسكو سامبلينغ، فورت أتكينسون، ويسكونسنB01318أكياس فلتر لتخزين عينات طعام لأغراض التخصيب المسبق.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

LAMP DNA

مقالات ذات صلة