توصيل الجزيئات الحيوية الفلورية المعتمدة على الحفر الكهربائي إلى الخلايا البكتيرية

الملخص

المصدر: أيغرين، إل. وآخرون. الاستيعاب والمراقبة للجزيئات الحيوية الفلورية في الكائنات الدقيقة الحية عبر الحفر الكهربائي. J. Vis. Exp. (2015)

يوضح الفيديو كيفية توصيل الجزيئات الحيوية الفلورية إلى خلايا ميكروبية كهروفية باستخدام الحفر الكهربائي. تبدأ العملية بإدخال حمض نووي أو بروتينات موسومة بالفلوروفور إلى نظام تعليق الخلايا المبرد. ثم يتم تطبيق نبضة عالية الجهد لإنشاء مسام غشائية مؤقتة، مما يمكن دخول الجزيئات الحيوية إلى السيتوبلازم. بعد الاستعادة، تخضع الخلايا للغسل والترشيح لإزالة الجزيئات غير الداخلية أو المرتبطة بالسطح. وأخيرا، يتم تركيب الخلايا الموسومة لتصوير الفلورة لرؤية المكونات داخل الخلية.

البروتوكول

1. التقشير الكهربائي

1. حضانة المرض
   1. أضف ما يصل إلى 5 ميكرولتر من الجزيئات الموسومة المخزنة في محلول منخفض الملح (< ملح 50 ملليمول) إلى عدد واحد من الخلايا المؤهلة (20 ميكرولتر بكتيريا أو 50 ميكرولتر خميرة) وحضن لمدة 10 دقائق على الثلج.
      ملاحظه: يرتبط تركيز الجزيئات الموسومة بالفلورية في المحاليل المخزنة وبالتالي كمية الجزيئات الموسومة التي تضاف إلى الخلية قبل التسامية الكهربائية مباشرة بكفاءة التحميل (الشكل 1 والنقاش). نظرا لأن بعض البروتينات أقل توافقا مع ظروف منخفضة الملح، فقد يزداد تركيز الملح في مخزن التخزين، لكن حجم الجزيئات الموسومة التي تضاف إلى الخلايا قبل التعرض للحفر الكهربائي يجب أن يقل.
   2. انقل خليط الخلايا والجزيئات الحيوية الموسومة إلى كوفيت كهربائي مبرد مسبقا (بمسافة 0.1 و0.2 سم للبكتيريا والخميرة على التوالي). انقر بلطف على الكوفيت على الطاولة لإزالة أي فقاعات محتملة من المحلول.
   3. ضع الكوفيت في الفتحة الكهربائية وطبق نبضة كهربائية عالية الجهد على المحلول (0.9 إلى 1.8 كيلوفولت/سم، انظر المناقشة لمزيد من التفاصيل حول اختيار الجهد). تشكل هذه النبضة مسامحا عابرة في أغشية الخلايا، مما يسمح للجزيئات الحيوية الموسومة بالانتشار داخل الخلايا.
   4. تحقق من أن ثابت الزمن المعروض على الكهرباء هو بين 4 إلى 6 مللي ثانية. الثوابت الزمنية المنخفضة غالبا ما تكون بسبب تركيز الملح المرتفع جدا و/أو وجود فقاعات في الكوفيت، مما يؤدي إلى تحميل منخفض جدا أو انعدام تحميل للخلايا.
2. الانتعاش
   1. مباشرة بعد الحفر الكهربائي، أضف 500 ميكرولتر من الوسط الغني مثل المرق المثالي الفائق مع كبت الكاتابولايت (SOC)، الوسط المعرف الغني EZ، مستخلص الخميرة من بيبتون ديكستروز (YPD)، أو أي وسط غني إلى الخلايا.
   2. حضن العينة عند 37 درجة مئوية للبكتيريا و29 درجة مئوية للخميرة لمدة 2 إلى 10 دقائق. لقياسات القابلية للحياة، حيث يرغب المستخدم في تقييم نسبة نمو وانقسام الخلايا بعد التسامية الكهربائية، استخدم وقت استرداد أطول (حتى ساعة واحدة) لأننا نلاحظ أوقات التأخير قبل الانقسام الأول.
3. خطوات الغسيل
   1. غسل الخلايا لإزالة أي جزيئات حيوية غير داخلية عن طريق تدوير الخلايا لمدة دقيقة واحدة عند 3300 × جرام و4 درجات مئوية. تخلص من المادة الفائقة وأعد تعليق الخلايا في محلول ملحي مخزن بالفوسفات 500 ميكرولتر (PBS).
      ملاحظه: لكل عينة، حضر مجموعة تحكم سلبية لخلايا تم حضانها بنفس كمية الجزيئات الحيوية الموسومة ولكن دون أن يتم تقطيعها كهربائيا وغسولها بنفس طريقة العينة الرئيسية.
   2. كرر الخطوات السابقة ثلاث مرات.
   3. في حالة استيعاب البروتين، قم بتحسين عملية الغسيل بناء على خصائص وسلوك البروتين الموسوم به. الخطوات التالية هي أمثلة على التحسينات الممكنة:
      1. قم بإجراء أول ثلاث دورات غسيل باستخدام PBS الذي يحتوي على 100 ملليمول NaCl و0.005٪ ترايتون X-100 لإزالة البروتينات غير الداخلية التي قد تلتصق بالغشاء الخارجي للخلية.
         1. قم بترشيح الخلايا الكهربائية باستخدام فلتر مسام بقطر 0.22 ميكرومتر مركب داخل أنبوب طرد مركزي دقيق بسعة 1.5 مل عن طريق توصيل الخلايا الكهربائية إلى الفلتر. قم بتدوير التدفق لمدة 3 دقائق عند 800 × g و4 درجات مئوية. تخلص من التدفق عبر الماء. أضف 500 ميكرولتر من PBS الجديدة فوق الخلايا وقم بتدويرها مرة أخرى كما كان من قبل، وكرر هذه الخطوات مرة واحدة.
      2. أضف كمية صغيرة من بروتياز K (10 نانوغرام في 500 ميكرولتر PBS) خلال دورة الغسيل الأولى للسماح بهضم أي بروتين غير داخلي.
   4. قم بتدوير الخلايا لمدة دقيقة واحدة عند 3300 × جرام و4 درجات مئوية. تخلص من المادة الفائقة وأعد تعليق الخلايا في 150 ميكرولتر من PBS.
   5. انشر محلول الخلية المحملة على وسادة الأغاروز عن طريق إزالة الانزلاق العلوي للغطاء وتوزيع 10 ميكرولتر من تعليق الخلية قطرة قطرة. استبدل غطاء نظيف محترق غير مستخدم (لا سمك 1.5، مطابق لمواصفات المجهر) على أعلى الوسادة واضغط برفق شديد على الشريحة.
   6. حماية الخلايا الكهربائية من الضوء عن طريق تخزين الوسائد في صندوق معتم أثناء تصوير عينات مختلفة.

النتائج

الشكل 1: عد عدد الجزيئات الداخلية باستخدام تحليل التبييض الضوئي. (أ) تحليل التبييض الضوئي أحادي الخلية. أمثلة على تتبع زمني لشدة الفلورة (أزرق: بيانات خام؛ أحمر: ملاءمة؛ تداخل داخلية: صور WL والفلورة للإشريكية القولونية...

المواد