تحضير عينات ميكسوكوكوس زانثوس للتصوير الخلوي الحي

الملخص

المصدر: شوماخر، د.، وآخرون. تصوير الخلايا الحية الفلورية لدورة الخلايا الخضرية الكاملة للبكتيريا الاجتماعية بطيئة النمو Myxococcus xanthus. J. Vis. Exp. (2018)

يوضح هذا الفيديو تحضير وتصوير Myxococcus xanthus، وهي بكتيريا تربة بطيئة النمو. تزرع الثقافة في وسط، وتطبق على غطاء مع ميكروكرات فلورية، وتغطيها طبقة أغاروز مدفأة مسبقا لدعم الترطيب وإمداد العناصر الغذائية. يتيح هذا الإعداد التصوير الحي طويل الأمد بالفاصل الزمني للعمليات الخلوية أثناء انقسام الخلايا البكتيري.

البروتوكول

1. تحضير عينات المجهر

ملاحظه: توضع الخلايا التي يجب رؤيتها بالمجهر على غطاء المجهر ثم تغطيها وسادة أغاروز تحتوي على المغذيات. يتم لصق غطاء الغطاء على إطار بلاستيكي أو معدني لتوفير الدعم الميكانيكي. استعدادا للمجهر، يجب تحضير وسادة كبيرة تحتوي على 1٪ أغاروز/TPM/0.2٪ CTT مسبقا كما هو موضح في الخطوات 2.1 - 2.3. يرجى أيضا الرجوع إلى جدول المواد للمنتجات المستخدمة هنا.

1. تحضير 500 مل من مخزن TPM (10 ملليمول، ثلاثي HCl pH 7.6، 1 مللي مولار KH₂PO₄ pH 7.6، 8 مللي مولار MgSO₄) وتعقيم باستخدام فلتر على سطح الزجاجة.

ملاحظه: يمكن تخزين المخزن المعقم لعدة أشهر في درجة حرارة الغرفة.

2. تحضير محلول مجهر 1٪ من الأغاروز يحتوي على 0.2٪ CTT (اخلط 1 جرام من الأغاروز مع 80 مل من محلول TPM و20 مل من وسط CTT بنسبة 1٪). سخن في فرن ميكروويف حتى يذوب الأغاروز.

ملاحظه: نسبة CTT بنسبة 0.2٪ كافية للسماح للخلايا بالنمو ومنع المجاعة. التركيزات الأعلى من CTT في وسط المجهر ستؤدي إلى فلورة خلفية عالية.

3. املأ طبق بترى بالأغاروز المنصهر بسماكة 0.5 سم (لطبق بتري مربع بحجم 11.5 سم × 11.5 سم، يتطلب حوالي 60 مل من الأغاروز المنصهر) واتركه يبرد إلى درجة حرارة الغرفة.

ملاحظه: يمكن تخزين وسادة الأروز عند 4 درجات مئوية في بيئة رطبة لمدة تصل إلى يومين.

1. سخن وسادة 1٪ أغاروز/TPM/0.2٪ CTT على 32 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 15 دقيقة قبل الاستخدام.

ملاحظه: لتحضير الخلايا للمجهر، اتبع الخطوات 2.4 - 2.8.

4. وضع غطاء زجاجي معقم (60 مم × 22 مم، السماكة: 0.7 مم) على إطار بلاستيكي أو معدني به ثقب في المنتصف (الشكل 1A); يعمل هذا الإطار كدعم ميكانيكي للانزلاق الرقيق ويساعد في تقليل الانزلاق أثناء المجهر. ثبت غطاء الغطاء على الإطار باستخدام شريط لاصق.

1. لتحضير الإطار، اقطع إطارا بحجم 75 مم × 25 مم من صفيحة معدنية بسماكة 1 مم، ثم اقطع ثقبا بحجم مناسب (20 مم × 30 مم في هذه التجربة) في المنتصف.

5. أضف 10 - 20 ميكرولتر من خلايا M. xanthus النموة أسيا على غطاء الغطاء.

6. إضافة كرات فلورية بقطر 0.5 ميكرومتر كعلامات ائتمانية للخلايا لتبسيط تتبع الخلايا أو البروتينات في تسجيلات الزمن.

1. تخفيف الكرات المجهرية بنسبة 1:100 في مخزن TPM وتخزينه عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى عدة أشهر. اهز جيدا قبل الاستخدام وأضف 5 - 10 ميكرولتر من الكرات الدقيقة المخففة إلى الخلايا.

ملاحظه: هنا، تم استخدام كرات دقيقة فلورية في جميع القنوات الفلورية الزرقاء والخضراء والصفراء والحمراء الشائعة.

7. اقطع وسادة صغيرة بحجم غطاء الغطاء الكبير المسخن مسبقا 1٪ أغاروز/TPM/0.2٪ CTT ووضعه فوق الخلايا (الشكل 1B). ضع غطاء فوق وسادة أجاروز 1٪ أجاروز/TPM/0.2٪ CTT لمنع التبخر والحفاظ على الخلايا في بيئة رطبة.

ملاحظه: الانزلاق الغطاء وحده سيمنع التبخر الكبير لمدة لا تقل عن ساعتين. لتسجيلات الزمن الأطول، يجب إغلاق وسادة 1٪ أغاروز/TPM/0.2٪ CTT وساندويتش غطاء الغطاء بطبقة بارافين لمنع التبخر.

8. حضن عينة المجهر عند 32 درجة مئوية لمدة 15 - 20 دقيقة للسماح للخلايا بالالتصاق بأسفل وسادة الأغاروز. ثم ابدأ تسجيلات المجهر بتقنية التايم لابس.

النتائج

الشكل 1: مخطط الإعداد التجريبي المستخدم طوال هذه الدراسة. (أ) يعمل إطار معدني أو بلاستيكي كدعم للعينة. يتم تثبيت غطاء على الإطار المعدني بواسطة شريط لاصق لتقليل حركة العينة. (ب) عرض جانبي لإعداد العينة التجر...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
DMI6000B مع AFC	أنظمة لايكا الدقيقة	11888945	مجهر فلوري واسع المجال مقلوب آلي مع تحكم تكيفي في التركيز
إطار التثبيت العالمي	أنظمة لايكا الدقيقة	11532338	حامل المسرح لأحجام عينات مختلفة
زيت HCX PL FLUOTAR 100X/1.30 PH3	أنظمة لايكا الدقيقة	11506197	هدف تباين الطور
كاميرا أوركا فلاش 4.0	هاماماتسو	11532952	كاميرا sCMOS بدقة 4.0 ميجابكسل لالتقاط الصور
مجموعة المرشحات TXR ET, k	أنظمة لايكا الدقيقة	11504170	مجموعة مرشحات الفلورة، مثال: 560/40 Em: 645/75
مجموعة المرشح L5 ET، k	أنظمة لايكا الدقيقة	11504166	مجموعة مرشحات فلورية، مثال: 480/40 Em: 527/30
مجموعة المرشح YFP ET, k	أنظمة لايكا الدقيقة	11504165	مجموعة مرشحات الفلورة، مثال: 500/20 Em: 535/30
برو سكان III	قبل	H117N1، V31XYZEF، PS3J100	وحدة تحكم أتمتة المجهر مع مركز تحكم تفاعلي
مصدر ضوء EL 6000	أنظمة لايكا الدقيقة	11504115	مصدر الضوء الفلوري الخارجي
الحاضنة BLX بلاك	بيكون	11532830	غرفة الحضانة السوداء المحيطة بالمجهر
تمب كنترول 37-2 الرقمي	أنظمة لايكا الدقيقة	11521719	التحكم الآلي في درجة الحرارة لغرفة الحضانة
جنتمايسين كبريتات	كارل روث	233.4	جنتامايسين
أوكسي تتراسيلين ديهيدرات	سيغما ألدريتش	201-212-8	أوكسي تترا سيكلين
كبريتات الكاناميسين	كارل روث	T832.3	كاناميسين
فلتر الزجاجة Filtropur BT25 0.2	سارستيدت	831,822,101	فلتر غطاء الزجاجة لتعقيم المخازن
Deckgläser	VWR	630-1592	غطاء زجاجي (60 × 22 مم، السمك: 0.7 مم)
سيكيم LE agarose	لونزا	50004	أغاروز لشرائح المجهر
لايكا ميتامورف AF	أنظمة لايكا الدقيقة	11640901	برمجيات التحكم في المجهر وبرمجيات تحليل الصور
رباعي النقاط الميكروسبيريس، 0.5 ميكرومتر	ثيرموفيشر	T7281	الكرات الفلورية الدقيقة
طبق بتري	غرينر بيو-ون	688102	طبق بتري مربع 120 مم × 120 مم × 17 مم لألواح الأغاروز
بي دي باكتو كاسيتون	بيكتون ديكنسون	225930	كاسيتون
بارافيلم إم	VWR	291-1213	بارافيلم
تريس(هيدروكسي ميثيل)-أمينوميثان	كارل روث	AE15.2	تريس
كبريتات المغنيسيوم هيبتاهيدرات	كارل روث	P027.2	كبريتات المغنيسيوم
فوسفات البوتاسيوم ثنائي الهيدروجين في البولاسيوم البول العضو.	كارل روث	3904.1	فوسفات البوتاسيوم ثنائي الهيدروجين
1٪ متوسط CTT: 1٪ (بدون خدع) BD باكتو™ كاسيتون، 10 ملليموتر تريس-HCl pH 8.0، 1 ملليمولار لمحلول فوسفات البوتاسيوم pH 7.6، 8 ملليمولار MgSO₄			وسيط الزراعة لميزانثوس
مخزن TPM: 10 ملليمولار Tris-HCl pH 8.0، 1 ملليمولار محلول فوسفات البوتاسيوم pH 7.6، 8 ملليمولار MgSO₄			مخزن مؤقت لتحضير شرائح المجهر ل M.xanthus