تقييم نشاط الشابرون البكتيري من خلال التفتيش الحراري لنموذج بروتين

الملخص

المصدر: دال، ج. وآخرون. اكتشاف النشاط المعتمد على الرقم الهيدروجيني لمادة الإشريكية القولونية Chaperone HdeB في المختبر وفي الجسم الحي. J. Vis. Exp. (2016)

يعرض هذا الفيديو اختبارا يعتمد على مطياف الفلورة لتقييم نشاط الشابرون على بروتين الركيزة تحت إجهاد الحمض والحرارة. يوضح الخطوات لمراقبة تطور الركيزة وتجمعها من خلال تشتت الضوء، ويقارن الظروف مع وبدون المرافق المراقب.

البروتوكول

1. اختبار نشاط الشابرون باستخدام انزيم مالات ديهيدروجيناز (MDH) الذي يتفتح حراريا

ملاحظه: تمت مراقبة تأثير HdeB المنقى على تجمع ديهيدروجيناز ميتوكوندريا الخنازيري المنفتح حراريا عند قيم pH مختلفة كما هو موضح أدناه. جميع تركيزات البروتين المذكورة تشير إلى تركيز المونومر.

1. لتحضير MDH، قم بتحليل MDH عند 4 درجات مئوية طوال الليل مقابل 4 لتر من العزل C (50 ملليمولار فوسفات البوتاسيوم، 50 ملليمولار كلوريد الصوديوم (NaCl)، pH 7.5) وتركيز البروتين إلى حوالي 100 ميكرومومول باستخدام وحدات مرشح طرد مركزي مع وزن جزيئي يبلغ 30 كيلو دالتون.
   ملاحظه: يتطلب الأمر غسيل كلى دقيق لMDH لأن MDH يعطى كمحلول كبريتات الأمونيوم.
2. لإزالة التجمعات، قم بعمل طرد مركزي للبروتين لمدة 20 دقيقة عند 20,000 × جرام عند 4 درجات مئوية. حدد تركيز MDH عن طريق الامتصاص عند 280 نانومتر (ε_{280 نانومتر} = 7,950 ^{م-1 سم-1}). جهز 50 ميكرولتر من MDH وقم بتجميد اللغات السريعة للتخزين.
3. ضع كوفيت كوارتز بحجم 1 مل في مطياف فوتومتر فلوري مزود بحوامل عينات ومحركات تحكم في درجة الحرارة. اضبط λ_ex/em على 350 نانومتر.
4. أضف كميات مناسبة من محلول D المسخن مسبقا (43 درجة مئوية) (150 مللي مولار فوسفات البوتاسيوم، 150 مللي مولار NaCl) عند قيم الرقم الهيدروجيني المطلوبة (هنا: pH 2.0، pH 3.0، pH 4.0، وpH 5.0) إلى الكوفيت واضبط درجة الحرارة في حامل الكوفيت إلى 43 °م. الحجم الكلي هو 1,000 ميكرولتر.
5. أضف 12.5 ميكرومولار HdeB (أو بدلا من ذلك، نفس حجم مخزن تخزين HdeB للتحكم في المخزن) إلى المخزن، يليه إضافة 0.5 ميكرومولار MDH. ابدأ بمراقبة تشتت الضوء. حضن التفاعل لمدة 360 ثانية للسماح بفتح كمية كافية من MDH.
6. ارفع الرقم الهيدروجيني إلى 7 بإضافة حجم 0.16-0.34 من 2 M بدون مخزن K₂HPO₄ واستمر في تسجيل تشتت الضوء لمدة 440 ثانية أخرى.
7. اضبط مدى تجمع MDH الذي يتم تسجيله في غياب المشرف في نقطة زمنية محددة بعد التحييد (فيما بعد 500 ثانية، عند ملاحظة أقصى تشتت ضوئي ل MDH) إلى 100٪. تطبيع نشاط HdeB إلى إشارة تشتت الضوء ل MDH في غياب HdeB عند كل قيمة pH محددة.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
إنزيم المالات ديهيدروجيناز (MDH)	روش	10127914001
فوسفات البوتاسيوم (مونوبيسيك)	فيشر ساينتيفك	BP362-500
فوسفات البوتاسيوم (ديباسيك)	فيشر ساينتيفك	BP363-1
مطياف الفلورة F-4500	هيتاشي	FL25
كوفيت خلية الفلورة	تحليلات هيلما	119004F-10-40
حمض الهيدروكلوريك	فيشر ساينتيفك	A144-212
هيدروكسيد الصوديوم	فيشر ساينتيفك	BP359-500
وحدات مرشح أيكون ألترا طرد مركزي 30K	ميليبور	UFC803024
كلوريد الصوديوم	فيشر ساينتيفك	S271-10
غشاء الغسيل الكلوي Spectra/Por 1 MWCO: 6 كيلو دالتون	مختبرات سبيكتروم	132650
مطياف الفوتومتر فاريان كاري 50	أجيلينت تك