تقييم الدور الوقائي للمركب المنشط بالحمض في الإشريكية القولونية تحت ضغط الحمض

الملخص

المصدر: دال، ج. وآخرون. اكتشاف النشاط المعتمد على الرقم الهيدروجيني لمادة الإشريكية القولونية Chaperone HdeB في المختبر وفي الجسم الحي. J. Vis. Exp. (2016)

يوضح هذا الفيديو استخدام مزارع الإشريكية القولونية المؤتلفة لتقييم التأثير الوقائي لشابرون المنشط بالحمض أثناء الإجهاد الحمضي. تكشف مراقبة نمو البكتيريا عن بقاء أفضل في المزارع التي تعبر عن الشابرونات مقارنة بالمجموعة الضابطة، مما يبرز دور الشابرونات في استقرار البروتين تحت ظروف الإجهاد.

البروتوكول

1. تأثير فرط تعبير تشيرون HdeB على بقاء الإشريكية القولونية تحت ضغط الحمض

ملاحظة: تم عزل الحمض النووي الجينومي لفيروس إشريكية قولونية MG1655 باستخدام بروتوكول قياسي.

1. تضخيم hdeB من إشريكية القولون، MG1655 بواسطة PCR باستخدام البرايمرات hdeB-BamH، I-rev، GGT، GGT، CTG، GGA، TCC، TTA، ATT، CGG، CAA، GTC، ATT وhdeB-EcoR، I-fw، GGT، GCC، GAA، TTC، AGG، AGG، CGC، ATG، AAT، ATC، TC، TCT، CTC C. C. C.
2. قم بإعداد تفاعل PCR في 50 ميكرولتر كالتالي: 10 ميكرولتر 5x مخزن بوليميراز، 200 ميكرومولار dNTPs، 0.5 ميكرومولار برايمر JUD2، 0.5 ميكرومولار برايمر JUD5، 150 نانوغرام DNA جينومي MG1655، 0.5 ميكرولتر DNA بوليميراز، أضف ddH₂O إلى 50 ميكرولتر.
3. قم بتضخيم hdeB كما يلي: الخطوة 1: 5 دقائق عند 95 درجة مئوية، دورة واحدة؛ الخطوة 2: 30 ثانية عند 95 درجة مئوية، 30 ثانية عند 55 درجة مئوية، 30 ثانية عند 72 درجة مئوية، 40 دورة؛ الخطوة 3: 10 دقائق عند 72 درجة مئوية.
4. تم استنساخ شظية PCR الناتجة إلى مواقع EcoRI و BamHI لبلازميد pBAD18 باستخدام الطرق القياسية لاستنساخ مواقع التقييد. قم بتنقية البلازميد باستخدام مجموعة تنقية البلازميدات وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. تحقق من البلازميد الناتج عن طريق التسلسل.
5. حول البلازميد الذي يعبر عن HdeB أو التحكم الفارغ pBAD18 إلى انفعال BB7224 (ΔrpoH) (النمط الجيني: F^-, λ^-, e14^-, [araD139]_B/r Δ(argF-lac)169 flhD5301 Δ(fruK-yeiR)725(fruA25) relA1 rpsL150(Sm^R) rbsR22 Δ(fimB-fimE)632(::IS1) ptsF25 zhf::Tn 10(Tc^S) suhX401 deoC1 araD⁺ rpoH::kan⁺) باستخدام خلايا كيميائية كفاءة.
   ملاحظه: هذا السلالة حساس للحرارة.
6. بعد 45 ثانية من الصدمة الحرارية عند 42 درجة مئوية وقبل الطلاء المعدني، يتم حضن الخلايا عند 30 درجة مئوية و200 دورة في الدقيقة. قم بتنفيذ عمليات استعمارية واحدة من النسخ الموجبة وحضانة طوال الليل عند 30 درجة مئوية. جهز مزرعة ليلية بسعة 50 مل لول_أمبير وزراعة الخلايا عند 200 دورة في الدقيقة و30 درجة مئوية.
7. قم بتخفيف الزراعة الليلية 40 ضعفا إلى 25 مل_{LB Amp} ونمو البكتيريا في وجود 0.5٪ أرابينوز (Ara) عند 30 درجة مئوية و200 دورة في الدقيقة إلى _O.D.600nm = 1.0 لتحفيز تعبير بروتين HdeB.
8. لتجارب إزاحة الرقم الهيدروجيني، استخدم LB_Amp+Ara لتخفيف الخلايا إلى _O.D.600nm مقداره 0.5 وضبط القيم الهيدروجينية المعنية (هنا: pH 2.0، pH 3.0، وpH 4.0) بإضافة أحجام مناسبة تبلغ 5 M HCl.
9. بعد نقاط التوقيت المحددة (pH 2، دقيقة واحدة؛ pH 3، 2.5 دقيقة؛ pH 4، 30 دقيقة)، يتم تحييد الثقافات بإضافة أحجام مناسبة تبلغ 5M NaOH.
10. مراقبة نمو الثقافات المعادلة في الزراعة السائلة لمدة 12 ساعة عند درجة حرارة 30 درجة مئوية باستخدام قياسات الجرعة الزائدة.

المواد