اكتشاف مسببات الأمراض للأسماك باستخدام تحليل التكرار المتغير العددي (VNTR)

الملخص

المصدر: جولا، س. وآخرون. تحليل متكرر متعدد المواقع متعدد الأرقام المتغيرة لبكتيريا يرسينيا روكيري الممرضة للأسماك بواسطة PCR متعدد القنوات والرحلان الكهربائي الشعري. J. Vis. Exp. (2019).

يوضح هذا الفيديو إجراء فصل الأمبليكونات التكرارية المتتالية ذات الرقم المتغير (VNTR) الموسومة بالفلورية، المشتقة من بكتيريا ممرضة للأسماك، باستخدام الرحلان الكهربائي الشعري لإنشاء ملفات إلكترونية محددة بالحجم لتحديد البكتيريا.

البروتوكول

1. إعداد الرحلان الكهربائي الشعري وظروف التشغيل

1. بعد تأكيد وجود مضخمات تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)، يتم تخفيف منتجات PCR بنسبة 1:10 (v/v) في مياه منقىة. أغلق، وخلط، واستخدم الطرد المركزي لفترة وجيزة.
2. عند العمل في خزانة بخار، حضر حجما من الخليط الرئيسي يتكون من 9 ميكرولتر من الفوراميد و0.5 ميكرولتر من الحجم القياسي لكل منتج PCR (مع السماح بزيادة 10٪ من الحجم). يقوم دوامة لفترة وجيزة بتوزيع 9.5 ميكرولتر على آبار على لوحة مناسبة لنظام الرحلان الكهربائي الشعري (CE) المتوفرة، قبل إضافة 0.5 ميكرولتر من منتج PCR المخفف. أغلق، وخلط، واستخدم الطرد المركزي لفترة وجيزة.
   أنذر: تعامل معها بحذر. خلط الفوراميد مع الماء ينتج حمض الفورميك، وهو سام.
3. باستخدام جهاز دورة PCR الحراري، قم بإزالة طبيعة العينات عند 95 درجة مئوية لمدة 3 دقائق قبل التبريد إلى 4 درجات مئوية إلى أجل غير مسمى. قم بجهاز الطرد المركزي لفترة وجيزة وتحميل اللوحة على نظام CE معاير وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
4. أجر تحليل الشظايا CE باستخدام الكواشف حسب التركيب المفضل والإعدادات التالية: 60 درجة مئوية؛ حقن 5 ثوان عند 1.6 كيلوفولت (32 فولت لكل سم)؛ مدة تشغيل 32 دقيقة عند 15 كيلو فولت (300 فولت لكل سم). عادة ما يستغرق تحليل شظايا CE ل 24 بئرا على 24 شعرا شعريا (50 سم) حوالي 50 دقيقة.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
محلل الجينات Avant 3500xL	ثيرمو فيشر العلمي	A30469	يستخدم لتحليل شظايا الرحلان الكهربائي الشعري.
وحدات BioNumerics7	الرياضيات التطبيقية	NA	يستخدم لإنشاء أشجار الامتداد الدنيا من بيانات MLVA.
أجهزة الطرد المركزي	حسب الفضل.	NA
أنابيب القفل الآمن من إيبندورف، 1.5 مل	إبندورف	30120086	أنابيب الطرد المركزي المستخدمة أثناء استخراج الحمض النووي.
الثلاجه	حسب الفضل.	NA
خزانة الأبخرة	حسب الفضل.	NA
برنامج جينمابر 5	ثيرمو فيشر العلمي	4475073	يستخدم لقراءة تخطيط البكاء الكهربائي من الرحلان الشعري.
حجم صبغة GeneScan 600 LIZ Standard v2.0	ثيرمو فيشر العلمي	4408399	معيار الحجم المستخدم أثناء الرحلان الكهربائي للشعير.
هاي-دي فوراميد	ثيرمو فيشر العلمي	4311320/4440753	يستخدم الفوراميد منزوع الأيونات أثناء الرحلان الكهربائي الشعري. جهز الأكواخ التشغيلية.
ماء ميلي-كيو	NA	NA	الماء المنقى المستخدم أثناء PCR والرحلان الكهربائي الشعري. الوصفة القياسية؛ تم إنتاجه داخليا.
مجموعة Multiplex PCR Plus	تشياغن	206151/206152
دورة PCR الحرارية	حسب الفضل.	NA
بوليمر POP-7 لمحللات جينية Dx 3500 Dx/3500xL	ثيرمو فيشر العلمي	A26077/4393713/4393709	مصفوفة الفصل المستخدمة أثناء الرحلان الكهربائي الشعري.
الثقافة النقية يرسينيا روكيري	NA	NA	مثلا الكريوبريدور المحجوز أو الطازج.
مياه خالية من RNase	تشياغن	NA	في: مجموعة Multiplex PCR Plus
مخزن Tris-borate-EDTA (TBE)	NA	NA	الوصفة القياسية؛ تم إنتاجه داخليا.
أجار الصويا من التربسين/آجار دم البقر	NA	NA	الوصفة القياسية؛ تم إنتاجه داخليا.
فورتكسر	حسب الفضل.	NA