استخراج الحمض النووي الجينومي من أنسجة أوراق النبات المصابة بالبكتيريا الممرضة

الملخص

المصدر: جولا، س. وآخرون. تحليل متكرر متعدد المواقع متعدد الأرقام المتغيرة لبكتيريا يرسينيا روكيري الممرضة للأسماك بواسطة PCR متعدد القنوات والرحلان الكهربائي الشعري. J. Vis. Exp. (2019).

يستخرج هذا البروتوكول الحمض النووي الجينومي من يرسينيا روكيري عن طريق تعليق مستعمرات معزولة في مياه فائقة النقاء وتطبيق الحرارة لتحليل الخلايا. يفصل الطرد المركزي المادة الفائقة التي تحتوي على الحمض النووي عن حطام الخلية، مما ينتج نموذجا للحمض النووي المناسب للنمذجة الجينية المعتمدة على PCR والتحليل الوبائي.

البروتوكول

1. زراعة واستخراج الحمض النووي الجيني للبكتيريا

1. ازرع مزارع Y. ruckeri النقية على أي نوع أجار مناسب (استخدم المؤلفون 5٪ من أجار دم البقر) وحضن عند 22 درجة مئوية لمدة يوم-يومين، أو 15 درجة مئوية لمدة 3-4 أيام.
2. من كل صفيحة أجار، اختر مستعمرة تمثيلية واحدة مع حلقة تلقيح وانقل إلى أنابيب طرد مركزي بسعة 1.5 مل تحتوي على 50 ميكرولتر من الماء فائق التنقية. تعليق، ودوامة لفترة وجيزة، واحتضن لمدة 7 دقائق على كتلة تسخين عند 100 درجة مئوية.
3. قم بالطرد المركزي بقوة 16,000 × جرام لمدة 3 دقائق واستخدام ماصة لنقل المادة الفائقة بعناية إلى أنبوب طرد مركزي فارغ بسعة 1.5 مل. انتقل إلى الخطوة التالية باستخدام المادة الفائقة كقالب للحمض النووي أو تخزينه عند -20 درجة مئوية حتى ذلك الوقت.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
مجموعة تنقية الحمض النووي الجينومية من ويزارد	بروميغا	A1120	مصدر تحلل النوى، RNase، ترسيب البروتين، وإعادة ترطيب الحمض النووي
النيتروجين السائل	منتجات الهواء	لا يوجد
ماسترسايكلر برو مع لوحة تحكم	إبندورف	6321000019
ميكروويف 1250 واط	باناسونيك	لا يوجد
طرد مركزي 5424 على الطاولة	إبندورف	05-403-93
حمام الماء الرقمي Isotemp 215	فيشر العلمي	15-462-15Q
الملعقة المعدنية	سيغما-ألدرتش	Z283274
الهاون والمدقة	سيغما-ألدرتش	Z247464
خلط دوامة LSE	كورنينج	6775
2-بروبانول	سيغما-ألدرتش	I9516
رؤوس معقمة بسعة 10 ميكرولتر	تيب ون	1161-3730
رؤوس معقمة بسعة 200 ميكرولتر	تيب ون	1163-1730
رؤوس معقمة بسعة 1250 ميكرولتر	تيب ون	1161-1750
مجموعة الماصة ذات الحجم المتغير	VWR	75788-460
إيثيديوم بروميد	سيغما-ألدرتش	E1510
أغاروز	IBI العلمي	IB70041
EDTA	ثيرمو فيشر العلمي	17892
حمض الخليك	فيشر كيميكال	A38-212
قاعدة تريس	سيغما-ألدرتش	10708976001
μcuvette	إبندورف	6138000018
أساسيات مطياف حيوي	إبندورف	6135000009