اختبار التراكب الناعم للأجار لاكتشاف القتل بوساطة الباكتيريوسين في Pseudomonas syringae

الملخص

المصدر: هوكيت، ك. ل.، وبالتروس، د. أ. استخدام تقنية تراكب الأجار الناعم لفحص المركبات المثبطة الناتجة عن البكتيريا. J. Vis. Exp. (2017)

يوضح هذا الفيديو إجراء اكتشاف القتل الناتج عن البكتيريوسين عن طريق رصد الفائض من سلالة متبرع ناتجة عن مضاد حيوي على طبقة أجار ناعمة تحتوي على سلالة اختبارية. المناطق الشفافة التي تتكون بعد الحضانة تشير إلى تثبيط البكتيريا.

البروتوكول

1. تحضير الطبقة الفوقية واختبار المواد الفائقة للنشاط

1. قم بتلقيح مستعمرة واحدة من سلالة P. syringae ليتم اختبارها من حيث الحساسية في 3 مل من KB (ميديوم ب كينغز)، ثم حضنها طوال الليل مع هز في درجة حرارة الغرفة.
2. في صباح اليوم التالي، قم بتخفيف الثقافة بنسبة 1/100 إلى لوحة مفاتيح جديدة. حضن لمدة 3-4 ساعات مع هز في درجة حرارة الغرفة.
3. تحضير أجار مائي معقم عن طريق تعليق أجار بمقدار 0.35-0.7٪ (مع الزجاجة) في مياه فائقة النقي.
   ملاحظه: يمكن إذابة مخزون من أجار الماء الطري في الميكروويف وإعادة استخدامه مرارا؛ لا حاجة لتحضير طبقة جديدة لكل تجربة. إذا تم إعادة استخدام الأجار المائي، فمن الضروري التأكد من ذوبه الكامل بعد التسخين في الميكروويف. وإذا لم يكن كذلك، فإن الطبقة الفوقية ستكون ذات نسيج حبيبي عند التصلب مما يصعب تفسيرها.
4. قبل الاستخدام، حافظ على الأجار الطري المنصهر في حمام ماء بدرجة حرارة 60 درجة مئوية. باستخدام ماصنة مصلية معقمة، انقل 3 مل من الأجار الطري إلى أنبوب زراعة معقم. أعد أنبوب الزراعة إلى حمام الماء للحفاظ على الحالة المنصهرة.
5. لصب طبقة الغطاء، اترك الأجار المنصهر ليبرد أولا (يجب أن يشعر بالدفء لكن ليس ساخنا عند اللمس)، لكن لا تدعه يتصلب.
6. في غطاء معقم، يتم تلقيح 100 ميكرولتر من ثقافة الاختبار في الأجار الطري والدوامة للخلط. قم بتدوير الزراعة يدويا لمدة 10-15 ثانية، ثم صبها على أجار قاسي (أجار KB). قم بإمالة اللوحة في جميع الاتجاهات لضمان تغطية الأجار الناعمة للأجار السفلي بشكل متساو.
   ملاحظه: يمكن أن يكون الأجار السفلي أي وسط متماسك (1.5٪ أجار) ينمو عليه السلالة التجريبية بقوة. لطبق بتري قياسي بقطر 100 مم، استخدم ~20 مل من الوسط المذاب. يمكن تحضير الأجار السفلي قبل عدة أسابيع (إذا تم الحفاظ عليه عند 4 درجات مئوية دون تجفيف) أو يمكن تحضيره في نفس اليوم.
7. غط الطبق ودعه ليتصلب لمدة 20-30 دقيقة. كن حذرا من عدم إزعاج اللوح أثناء تصلبه.
8. بعد التصلب، ضع 2-5 ميكرولتر من المادة الفائقة على الطبقة الفوقية. دع الأطباق تحتضن طوال الليل في درجة حرارة الغرفة. راقب وسجل النتائج في صباح اليوم التالي.
   ملاحظه: قد يكون من المفيد إجراء ورصد من خلال تخفيف متسلسل للسوبرناتانت. سيسمح ذلك للباحثين بالتمييز بين النشاط المضاد للبكتيريوفاج ونشاط إزالة البكتيريوسين. في هذه الحالة، ينصح بإجراء تخفيفات بنسبة 1:5 أو 1:10.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
ميتوميسين سي	سانتا كروز للتكنولوجيا الحيوية	SC-3514	مسرطنه. استخدم معدات الحماية الشخصية المناسبة (مثل القفازات، واقي العين، وقناع الوجه)، خاصة عند تحضير المحلول الأصلي.
الأجار بكتريولوجي	جينيسي ساينتيفك	20-274