عزل البكتيريا المتكيفة مع الإجهاد من خلال اختيار مستعمرة واحدة

الملخص

المصدر: جونغ، ه.، وآخرون. إجراء التطور التكيفي للكائنات الدقيقة في المختبرات باستخدام الكيموستات. J. Vis. Exp. (2016).

يوضح هذا الفيديو العزل الانتقائي ونمو البكتيريا المتكيفة مع الإجهاد من مزرعة تعرضت لظروف إجهاد طويلة الأمد. يتم طلاء الزراعة على أجار يحتوي على الإجهاد، ويتم اختيار مستعمرة واحدة لتطعيم وسط سائل بالمجهد. يتم قياس الامتصاص على فترات منتظمة لمراقبة النمو وتأكيد العزل الناجح للبكتيريا المتكيفة مع الإجهاد.

البروتوكول

1. تجهيز المعدات

1. احصل على جرة كيموستات (150-250 مل) أو قارورة إيرلنماير (250 مل) تحتوي على منفذ دخول ومخرج خارج. ربط المنافذ بأنابيب السيليكون، مما يسمح بمعدلات تدفق تتراوح بين 10-100 مل/ساعة. اختياريا، استخدم فتحة هواء، ومنفذ مخرج هواء، ومنافذ دخول ومخرج مياه مضبوطة في درجة الحرارة.
2. احصل على جهاز مناسب لبرطمان الكيموستات يوفر التحريك والتحكم في درجة الحرارة (أو استخدم حاضنة هز دوارية).
3. احصل على مضختين بريستالتيكيين لتوصيل وسط جديد وجمع الزرعة.
4. احصل على جرة خزان (10-20 لتر) تحتوي على منفذ مخرج متوسط ومنفذ مدخل هواء.
5. الحصول على أنابيب سيليكون مناسبة لمعدل التخفيف (أي التعريف 0.8 مم، نطاق التدفق 0.06-36 مل/دقيقة؛ أنابيب L/S 13).

2. التحضير المتوسط والتعقيم

1. الوسيط الابتدائي
   1. قم بإذابة 0.3 جرام جلوكوز، 0.08 جرام من كلوريد الأمونيوم (NH₄Cl)، 0.05 جرام كلوريد الصوديوم (NaCl)، 0.75 جرام ديهيدرات فوسفات الهيدروجين ثنائي الصوديوم (Na₂HPO_{4.2H 2}O)، و0.3 جرام من ديهيدرات فوسفات الهيدروجين ثنائي الصوديوم (KH₂PO₄) في 90 مل من الماء المقطر (D.W.) في جرة كيموستات.
   2. أغلق جرة الكيموستات مع الأنبوب باستخدام مشابك. لا تغلق فتحة التهوية.
   3. قم بتعقيم جرة الكيموستات في جهاز تعقيم عند درجة حرارة 121 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. بعد التعقيم، خزن جرة الكيموستات في درجة حرارة الغرفة.
   4. أذاب 0.02 جرام من كبريتات المغنيسيوم هبتاهيدرات (MgSO 4.7H₂O)، و0.01 جرام من كلوريد الكالسيوم (CaCl₂)، و0.1 ملغ من الثيامين في 10 ملليتر d.w. (المحلول A).
   5. محلول الفلتر A باستخدام حقنة ومرشح حقنة معقم مسبقا (مرشح مسام بحجم 0.45 ميكرومتر).
   6. أضف محلول A مرشح إلى جرة الكيموستات.
2. وسط الإجهاد
   1. أذاب 30 جرام جلوكوز، 8 جرام NH₄Cl، 5 جرام NaCl، 75 جرام Na₂HPO₄·2H₂O، 30 جرام KH₂PO₄، و300 جرام من سداسي هيدرات ثنائي الصوديوم (Na₂·succinate·H₂O؛ المجهد المستخدم في هذه التجربة) في 9.9 لتر D.W. في جرة خزان.
   2. أغلق جرة الخزان مع الأنبوب باستخدام المشابك. لا تغلق فتحة التهوية.
   3. قم بتعقيم جرة الخزان في جهاز تعقيم عند 121 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. بعد التعقيم، خزن البرطمان في درجة حرارة الغرفة.
   4. ذاب 2 جرام MgSO_{4.7H 2}O، 1 جرام CaCl₂، و10 ملغ ثيامين في 100 مل D.W. (محلول A).
   5. محلول الفلتر A باستخدام حقنة ومرشح حقنة معقم مسبقا (مرشح مسام بحجم 0.45 ميكرومتر).
   6. أضف محلول A مرشح إلى جرة الخزان.
   7. قم بتوصيل أنابيب السيليكون المعقمة بوعاء الخزان بشكل معقم وربط المضخات البائسة.
3. متوسط الإجهاد عالي التوتر
   1. جهز الوسط كما في القسم 2.2، ولكن مع تركيز أكبر من المجهد (أي 3-5 جرام/لتر أعلى في التكيف السوكسينات).
      ملاحظة: هذا البروتوكول مخصص للتكيف مع الضغط الذي يمكن توصيله عبر الوسط. في حالة الضغوط الفيزيائية مثل درجة الحرارة أو التحريك أو الإضاءة، يجب تصميم الزراعة وفقا لذلك.

3. الزراعة الأولية

1. قم بتطعيم مستعمرة واحدة من الإشريكية القولونية البرية (E. coli) في أنبوب اختبار بحجم 15 مل يحتوي على 4 مل من الوسط الأولي.
2. حضن أنبوب الاختبار في حاضنة اهتزاز لمدة 12 ساعة عند 37 درجة مئوية و220 دورة في الدقيقة.
3. انقل 1 مل من الزراعة المسبق معقم إلى جرة الكيموستات.
4. حضن جرة الكيموستات، مع توفير التهوية (الهواء 50 مل/دقيقة) والتحريك (200 دورة في الدقيقة) عند 37 درجة مئوية لمدة 6 ساعات.

4. التكيف مع التوتر

1. قم بتوصيل نهاية أنابيب السيليكون من المضخات إلى جرة الكيموستات.
2. شغل مضخة المخرج (10 مل/ساعة أو أكثر) واجمع الزرعة. ملاحظة: يجب أن تكون الزراعة في المرحلة الأسية، عادة بعد 4-8 ساعات من الزراعة الأولية.
3. تحقق من الكثافة البصرية (600 نانومتر) للثقافة من أنبوب المخرج.
4. شغل مضخة السحب (10 مل/ساعة، وهو معدل تخفيف 0.1 ساعة إلى 1).
5. تحقق من الكثافة البصرية للثقافة عند 600 نانومتر من أنبوب المخرج كل 24 ساعة.
6. شغل الكيموستات لمدة 96 ساعة (معدل دوران 9.6 مرة) أو أكثر. إذا كانت الكثافة الضوئية مستقرة، قم بتبديل الخزان الذي يحتوي على الوسط عالي الإجهاد. إذا كانت الكثافة الضوئية أقل من 0.2، أوقف مضخة التغذية لمدة 6 ساعات. أعد تشغيل مضخة المدخل وتحقق من أن الكثافة الضوئية فوق 0.2.
7. قم تدريجيا بزيادة تركيز المجهد عن طريق التحول إلى خزان يحتوي على تركيز إجهاد أعلى.
8. خذ عينات من الثقافة المعدلة كلما وصلت إلى مرحلة معينة (مثل سلالة متكيفة مع إجهاد سوكسينات 100 جرام/لتر)، وتخزينها لمزيد من التحليل الجيني.
9. لتخزين العينة، اخلط عينة الزراعة (0.5 مل) مع محلول جلسرول معقم بنسبة 80٪ (0.5 مل) وخزنها عند -80 درجة مئوية. ملاحظة: إذا اكتسب الكائن الميكروي القدرة على تحلل المجهد أثناء عملية ALE العليا، فإن تركيز المجهد في جرة التخمير ليس هو نفسه في الخزان الطازج.

5. عزل السلالة المتكيفة مع الإجهاد في مستعمرة واحدة

1. حضر وسط صفيحة أجار (1.6٪ أجار) يحتوي على نفس المجهد وبنفس تركيز الوسط.
2. قم بتلوين مصنع المخرج (0.1 مل) من الكيموستات، واحتضن عند 37 درجة مئوية لمدة 16 ساعة.
3. اختر مستعمرات واحدة من الطبق باستخدام عود أسنان معقم وقم بتطعينها في أنابيب اختبار بحجم 15 مل تحتوي على نفس عامل الإجهاد وبنفس التركيز المتوسط الموجود في الكيموستات، ثم احتضنها لمدة 6 ساعات.
4. انقل 1 مل من مرق الزراعة إلى قارورة إيرلنماير بحجم 250 مل تحتوي على 50 مل من الوسط. احصد 0.5 مل من مرق الزراعة كل ساعة، وقس جرعة الجرعة الزائدة عند 600 ميل بحري. قارن معدل نمو السلالة المتكيفة مع معدل السلالة البرية بناء على المسبب الضغطي.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
مخمر الكيموستات الصغير	شركة بيوترون	-	تم تصنيعها بواسطة طلب خاص
أنابيب السيليكون	كول-بارمر	ماسترفليكس L/S 13	يمكن أن يختلف حجم الأنبوب حسب معدل التخفيف وحجم جرة التخمير.
جرة الخزان	بيلكو	زجاجة تخزين الوسائط	20 لتر
المواد الكيميائيه	سيغما-ألدرتش	-	درجة الواشف
الجلوكوز	سيغما-ألدرتش	G5767	واشف ACS
NH₄Cl	سيغما-ألدرتش	A9434	بالنسبة لعلم الأحياء الجزيئي، المناسب لزراعة الخلايا، ≥99.5٪
NaCl	سيغما-ألدرتش	746398	مادة ACS، ≥99٪
Na₂HPO₄·2H₂O	سيغما-ألدرتش	4272	98.5-101%
KH₂PO₄	سيغما-ألدرتش	795488	مادة ACS، ≥99٪
MgSO₄·7H₂O	سيغما-ألدرتش	230391	مادة ACS، ≥98٪
CaCl₂	سيغما-ألدرتش	793639	مادة ACS، ≥96٪
ثيامين·HCl	سيغما-ألدرتش	T4625	درجة الواشف، ≥99٪
Na₂succinate·6H₂O	سيغما-ألدرتش	S2378	ReagentPlus، ≥99٪