فحص البكتيريا البحرية لعزل السلالات المسببة للتلوث

الملخص

المصدر: فيليلا، ه. د. م. وآخرون. البحث عن السلالات الميكروبية للمعالجة الحيوية وتطوير البروبيوتيك لأبحاث وحفظ الكائنات الميتا. J. Vis. Exp. (2019).

يوضح هذا الفيديو عزل البكتيريا البحرية التي تحلل الملوثات من خلال التخفيف المتسلسل، واختيار المستعمرات، والنمو في وسط يحتوي على EE2. باستخدام EE2 كمصدر كربون وحيد، يحدد البروتوكول السلالات البكتيرية القادرة على استقلاب هذا الملوث البيئي.

البروتوكول

1. جمع وتخزين المياه والشعاب المرجانية لعزل الميكروبات

ملاحظه: من الضروري أخذ إحداثيات ودرجة حرارة مواقع أخذ العينات. إذا أمكن، يمكن أن تساعد البيانات الوصفية مثل الملوحة، الرقم الهيدروجيني، العمق، وشدة الضوء أيضا في إيجاد طرق زراعة مضبوطة وتفسير البيانات في المستقبل. للحصول على نتائج موثوقة، احتفظ بالعينات مخزنة لأدنى مدة ممكنة. قد تتغير ميكروبيومات الماء والشعاب المرجانية بشكل كبير إذا لم تحفظ العينات عند درجة الحرارة المناسبة و/أو تم تخزينها لفترات طويلة. إذا لم تتم خطوة العزل فور الجمع، فمن الضروري الحفاظ على العينات عند 4 درجات مئوية حتى المعالجة. كلما طالت مدة تخزين العينات، حتى عند 4 درجات مئوية، زاد تغير مجتمع الميكروبات.

1. خذ عينات ويخزن مياه البحر.
   1. اجمع عينة بحجم 500 مل من الماء على الأقل ثلاث نسخ من كل موقع أخذ عينات مستهدفة. ويفضل استخدام زجاجات معقمة بأغطية براغي.
   2. إذا كنت تعالج الماء فور جمعها، احتفظ بالزجاجات على RT لفترة قصيرة. إذا كانت معالجة العينات تتم لاحقا، حافظ على حرارة الزجاجات عند 4 درجات مئوية.
2. خذ عينات من المرجان وخزنها.
   1. استخدم زوجا معقما من الكماشة لقطع شظايا المرجان من نفس موقع أخذ عينات المياه. لتجنب التلوث، المس المرجان فقط بقفازات معقمة.
   2. اشطف قطعة المرجان المأخوذة باستخدام محلول ملحي معقم بحجم 20 مل (3٪ NaCl في ماء مقطر) أو ماء بحر صناعي للتخلص من البكتيريا الحرة المتصلة بشكل فضفاض في مياه البحر.
   3. باستخدام الملقط، ضع كل جزء من الشعاب المرجانية في حاوية معقمة بسعة 250−500 مل مع غطاء لولبي يحتوي على محلول ملحي معقم.
   4. في المختبر، باستخدام ملقط وكماشة معقمة، تزن 5 جرام من شظايا المرجان باستخدام أطباق بترى معقمة بحجم 100 مم × 20 مم على ميزان وزن.
   5. انقل 5 جرام من عينة المرجان إلى هاون معقم وانقعه باستخدام مدقة معقمة.
   6. باستخدام ملعقة معقمة، انقل العينة المنقعة إلى قارورة زراعة معقمة تحتوي على 45 مل من محلول معقم 3٪ NaCl و10−15 خرزة زجاجية بحجم 5 مم. استخدم بعض محلول الملح المعقم بحجم 45 مل لغسل الملاط واستعادة أقصى كمية من النقع المعدني.
   7. حافظ على القارورة تحت تحريك مستمر (150 × ج) لمدة 16 ساعة عند درجة حرارة الماء في موقع العينة.
      ملاحظه: بالنسبة للشعاب المرجانية الضحلة، تتراوح درجة الحرارة المثلى بين 24−28 درجة مئوية. هذه الخطوة ستفصل الكائنات الدقيقة من أقسام مرجانية مختلفة، مثل تلك المرتبطة بخلايا المضيف، أو تلك التي تعيش داخل الأنسجة والهيكل العظمي. بعد هذه الخطوة، لا ينبغي تخزين الماكراتات المرجانية، ويجب تنفيذ خطوة العزل فورا.

2. عزل البكتيريا الكيميائية التي تحلل الإستروجين 17a-إيثينيليستراديول (EE2) من مياه البحر و/أو الشعاب المرجانية

1. اختر البكتيريا.
   ملاحظه: بعد الخطوات 1.1.2 و1.2.7، سيكون تركيز الكائنات الدقيقة في مياه البحر التي انفصلت عن الماكريات المرجانية المختلفة غير معروف ومتغير. لضمان عزل المستعمرات الميكروبية الفردية في أطباق بتري التي تحتوي على وسط الأجار، هناك حاجة إلى تخفيف متسلسل.
   1. قم بتخفيفات تسلسلية تصل إلى 10-9 في محلول ملحي معقم لعينات المرجان وحتى 10-6 لعينات المياه. تخفيف البيبيت لأعلى ولأسفل 5 مرات قبل التخلص من الطرف. أخذ عينات فورتكس لمدة 5 ثوان في كل مرة قبل تنفيذ التخفيف التسلسلي التالي.
   2. بيبيتي 100 ميكرولتر من كل مخفف على أطباق بتيري تحتوي على 3٪ مرق NaCl ليسوجيني (LB) وسط أجار، ووضعها في الطبق.
      ملاحظه: استخدم الأجار البحري (MA) كوسيط بديل. يطلب استخدام ثلاث نسخ من كل تخفيف للحصول على نتائج موثوقة.
   3. حضن الصفائح لمدة 1−3 أيام عند درجة الحرارة المستهدفة (مثلا 26 درجة مئوية). افحص اللوحات مرة واحدة يوميا.
   4. اختر وعزل المستعمرات التي تقدم أشكال نمو مميزة على صفائح جديدة باستخدام تقنية صفيحة الخطوط الخطوطية. كرر هذه الخطوة عدة مرات حسب الحاجة لنمو مستعمرات نقية على الأطباق.
   5. إذا لم يستمر الإجراء فورا في الخطوة 2.3.1، خزن المعزولات عند 4 درجات مئوية أو في الجلسيرون كما هو موضح في القسم 2.2.
2. حضر مخزون الجلسرول.
   ملاحظه: هذه الخطوة اختيارية ويمكن استخدامها لتخزين مخزون البكتيريا على المدى الطويل.
   1. اختر مستعمرات فردية من الصفيحة الطازجة أو من الصفائح المخزنة عند 4 درجات مئوية وقم بتطعينها بشكل مستقل في 2 مل من وسط LB المعقم.
   2. ضع الأنابيب تحت تحريك مستمر (150 × g) عند 24−28 درجة مئوية طوال الليل (ON).
   3. أضف 1 مل من الزراعة البكتيرية من الخطوة 2.2.2 والجلسيرول المعقم إلى تركيز نهائي 20٪ إلى 2 مل من المجمدة.
   4. اترك أجهزة التبريد تعمل عند 4 درجات مئوية.
   5. ضع مخزون بكتيريا الجلسرول عند -80 درجة مئوية حتى الحاجة.
3. قم بإجراء اختبار قدرة تدهور EE2.
   1. فعل العازلات في مرق LB أو وسط بديل. لهذا، اختر مستعمرة واحدة من الألواح الطازجة أو من الصفيحة المخزنة عند 4 درجات مئوية، وقم بتلقيح 2 مل من وسط LB المعقم. في حال كان مخزون الجلسرول، قم أولا بوضعه على صفائح LB Agar واحتضنه عند 24−28 °C فوق السطح لنمو مستعمرات فردية. ضع الأنبوب الذي يحتوي على وسط LB مائل تحت تحريك مستمر (150 × ج) عند 24−28 درجة مئوية فوق الصوت.
   2. بعد نمو البكتيريا، قم بعمل الحبيبات على الخلايا عن طريق طرد مركزها بحرارة 8000 × جرام لمدة 8 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT). تخلص من السوبرناتينت، وقم بتوصيل الأنابيب بلطف صعودا وهبوطا، ثم أعد تعليق الخلايا بحجم متساو (2 مل) من الماء المالح لغسل ما تبقى من المرق LB.
   3. كرر الخطوة 2.3.2 مرتين لضمان عدم وجود آثار لمصدر الكربون، مع إعادة تعليق الخلايا في حجم متساو من محلول ملحي. على سبيل المثال، إذا بدأ بزراعة 2 مل، أعد تعليق الخلايا في حجم نهائي من محلول ملحي بسعة 2 مل.
   4. قم بتلقيح الخلايا المغسولة والمعاد تعليقها في وسط زراعة بوشنيل هاس الأدنى (مرق BH) الذي يحتوي على EE2 كمصدر كربون وحيد.
      ملاحظه: يذوب EE2 في الإيثانول بتركيز نهائي قدره 5 ملغ/لتر في وسط الزراعة. قم بإجراء تغييرات في نوع الملوث و/أو تركيزه إذا لزم الأمر.
   5. تقييم نمو البكتيريا من خلال الكثافة البصرية عند 600 نانومتر و/أو وحدات تكوين المستعمرات (CFU) على وسط LB Agar لمدة 16−72 ساعة من الحضانة.
      ملاحظه: بدلا من ذلك، يمكن عزل الكائنات الدقيقة مباشرة على وسط أدنى يحتوي على EE2 أو مركبات أخرى كمصدر كربوني وحيد. هذه الخطوة ستوجه الاختيار وتتجنب النمو غير المرغوب فيه.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
زجاجة تخزين وسائط PYREX بسعة 500 مل	توماس ساينتفيك/كورنينغ	1743E20/1395-500	تستخدم لتذوق الماء.
زجاجات شفط بسعة 500 مل	توماس ساينتفيك/كورنينغ	1234B28/1220-2X	يستخدم لفصل كسور الزيت.
كماشة قاطعة سلكية بقياس 6 إنش	توماس ساينتفيك/ريستيك	1173Y64/23033	يستخدم لقطع شظايا المرجان.
17a-إثينيل إستراديول	معايير LGC	DRE-C13245100	يستخدم كمصدر الكربون الوحيد لصنع الوسط الانتقائي.
اجار	هيميديا	PCT0901-1 كجم	كان يستخدم لصنع وسائط صلبة.
مرق بوشنيل هاس	هيميديا	M350-500G	يستخدم كوسط أدنى ليتم تعزيزه بمصادر الكربون.
قارورة إيرلنماير	توماس ساينتفيك/DWK علوم الحياة (كيمبل)	4882H35/26500-125	يستخدم لزراعة النقع المرجاني باستخدام خرز زجاجي.
لوريا بيرتاني برق، ميلر (شورق ميلر لوريا بيرتاني)	هيميديا	M1245-1KG	يستخدم كوسيط غني لزراعة البكتيريا.
مارين آجار 2216 (زوبيل مارين آغار)	هيميديا	M384-500G	يستخدم كوسيط غني لزراعة البكتيريا.
حاضنة الهزاز المداري			يستخدم لاحتضان الوسائط السائلة والزيت.
حاضنة الألواح			تستخدم لحضانة الأطباق.
هاون ومدقة من الخزف	توماس العلمي/شركة يونايتد ساينتيفيك سبلايزز	1201U69/JMD150	يستخدم لنقع شظايا المرجان.
فلورومتر الكيوبت 2.0	إنفيتروجين		يستخدم لقياس كميات حمض نووي ومنتجات PCR.
الطرد المركزي المبرد			اعتدت على الطرد المركزي لزراعة البكتيريا.
مقياس الطيف الفوتوني			يستخدم لقياس الكثافة البصرية لمزارع البكتيريا.