الإثراء الانتقائي والعزل للبكتيريا البحرية المتحللة للنفط من عينات مياه البحر

الملخص

المصدر: فيليلا، ه. د. م. وآخرون. البحث عن السلالات الميكروبية للمعالجة الحيوية وتطوير البروبيوتيك لأبحاث وحفظ الكائنات الميتا. J. Vis. Exp. (2019)

يوضح هذا الفيديو العزل الانتقائي للبكتيريا البحرية المتحللة للنفط من خلال تخصيب عينات مياه البحر على وسائط قائمة على النفط، مما يمكن من استعادة السلالات النقية التي يمكن استخدامها في معالجة النفط الخام البيولوجية وتنظيف البيئة.

البروتوكول

1. جمع وتخزين المياه والشعاب المرجانية لعزل الميكروبات

ملاحظه: من الضروري أخذ إحداثيات ودرجة حرارة مواقع أخذ العينات. إذا أمكن، يمكن أن تساعد البيانات الوصفية مثل الملوحة، الرقم الهيدروجيني، العمق، وشدة الضوء أيضا في إيجاد طرق زراعة مضبوطة وتفسير البيانات في المستقبل. للحصول على نتائج موثوقة، احتفظ بالعينات مخزنة لأدنى مدة ممكنة. قد تتغير ميكروبيومات الماء والشعاب المرجانية بشكل كبير إذا لم تحفظ العينات عند درجة الحرارة المناسبة و/أو تم تخزينها لفترات طويلة. إذا لم تتم خطوة العزل فور الجمع، فمن الضروري الحفاظ على العينات عند 4 درجات مئوية حتى المعالجة. كلما طالت مدة تخزين العينات، حتى عند 4 درجات مئوية، زاد تغير مجتمع الميكروبات.

1. خذ عينات ويخزن مياه البحر.
   1. اجمع عينات المياه بحجم 500 مل على الأقل في ثلاث نسخ من كل موقع أخذ عينات مستهدفة. ويفضل استخدام زجاجات معقمة بأغطية براغي.
   2. إذا كنت تعالج الماء فور جمعه، حافظ على الزجاجات في درجة حرارة الغرفة لفترة قصيرة. إذا كانت معالجة العينات تتم لاحقا، حافظ على حرارة الزجاجات عند 4 درجات مئوية.
2. خذ عينات من المرجان وخزنها.
   1. استخدم زوجا معقما من الكماشة لقطع شظايا المرجان من نفس موقع أخذ العينات مع عينات المياه. لتجنب التلوث، المس المرجان فقط بقفازات معقمة.
   2. شطف قطعة المرجان المأخوذة باستخدام محلول ملحي معقم بحجم 20 مل (3٪ NaCl (كلوريد الصوديوم) في ماء مقطر) أو ماء بحر صناعي للتخلص من البكتيريا الحرة المتصلة بشكل فضفاض في مياه البحر.
   3. باستخدام الملقط، ضع كل جزء من الشعاب المرجانية في حاوية معقمة بسعة 250−500 مل مع غطاء لولبي يحتوي على محلول ملحي معقم.
   4. في المختبر، باستخدام ملقط وكماشة معقمة، تزن 5 جرام من شظايا المرجان باستخدام أطباق بترى معقمة بحجم 100 مم × 20 مم على ميزان وزن.
   5. انقل 5 جرام من عينة المرجان إلى هاون معقم وانقعه باستخدام مدقة معقمة.
   6. باستخدام ملعقة معقمة، انقل العينة المنقعة إلى قارورة زراعة معقمة تحتوي على 45 مل من محلول معقم 3٪ NaCl و10−15 خرزة زجاجية بحجم 5 مم. استخدم بعض محلول الملح المعقم بحجم 45 مل لغسل الملاط واستعادة أقصى كمية من النقع المعدني.
   7. حافظ على القارورة تحت تحريك مستمر (150 × ج) لمدة 16 ساعة عند درجة حرارة الماء في موقع العينة.
      ملاحظه: بالنسبة للشعاب المرجانية الضحلة، تتراوح درجة الحرارة المثلى بين 24−28 درجة مئوية. هذه الخطوة ستفصل الكائنات الدقيقة من أقسام مرجانية مختلفة، مثل تلك المرتبطة بخلايا المضيف، أو تلك التي تعيش داخل الأنسجة والهيكل العظمي. بعد هذه الخطوة، لا ينبغي تخزين الماكراتات المرجانية، ويجب تنفيذ خطوة العزل فورا.

2. عزل البكتيريا التي تحلل النفط من مياه البحر و/أو الشعاب المرجانية

1. جهز وسط أدنى يحتوي على نسبة قابلة للذوبان في الماء في الزيت (oWSF) ونسبة غير قابلة للذوبان في الماء (oWIF) كمصدر كربون وحيد.
   1. أضف 1−2٪ من النفط الخام إلى 500 مل من الماء المقطر المعقم. استخدم قارورة فلتر مفتوحة في الأسفل لإزالة الجزء القابل للذوبان دون إزعاج الطبقة العليا من الجزء غير القابل للذوبان.
   2. حافظ على الخليط تحت تحريك مستمر عند 24−28 درجة مئوية عند 150 × جرام لمدة 48 ساعة.
   3. ضع قارورة الفلتر التي تحتوي على كسور النفط الخام على سطح مستقر وانتظر 10−20 دقيقة للسماح بفصل الأجزاء القابلة للذوبان وغير القابلة للذوبان.
   4. انقل ال oWSF إلى قارورة معقمة جديدة، مما يوفر oWIF بفتح قارورة الفلتر السفلية السفلية وإزالة الجزء القابل للذوبان.
   5. باستخدام كل كمية oWSF التي تم استريادها في الخطوة السابقة (~400 مل)، حضر 1 لتر من وسط أجار BH (بوشنيل هاس) الأدنى يحتوي على oWSF كمصدر كربون وحيد.
   6. باستخدام ال oWIF المتبقي في القارورة من الخطوة 2.1.4، حضر لتر واحد من وسط BH أجار الأدنى الذي يحتوي على oWIF كمصدر كربون وحيد.
2. عزل البكتيريا التي تحلل oWSF وoWIF.
   1. باستخدام الماء ومرجان النقع من الخطوتين 1.1.2 و1.2.7 على التوالي، قم بتخفيف العينات حتى ^10-6 في محلول ملحي معقم كما هو موضح أدناه.
3. قم بتخفيفات تسلسلية تصل إلى ^10-9 في محلول ملحي معقم لعينات المرجان وحتى ^10-6 لعينات المياه. تخفيف البيبيت لأعلى ولأسفل 5 مرات قبل التخلص من الطرف. أخذ عينات فورتكس لمدة 5 ثوان في كل مرة قبل تنفيذ التخفيف التسلسلي التالي.
4. تحتوي على 100 ميكرولتر من كل مخفف على أطباق بترى تحتوي على وسط أغار BH-oWSF و BH-oWIF وطبقها.
5. حضن الصفائح لمدة 1−3 أيام عند درجة الحرارة المستهدفة (مثلا 26 درجة مئوية). افحص اللوحات مرة واحدة يوميا.
6. اختر وعزل المستعمرات التي تقدم أشكال نمو مميزة على صفائح جديدة باستخدام تقنية صفيحة الخطوط الخطوطية. كرر هذه الخطوة عدة مرات حسب الحاجة لنمو مستعمرات نقية على الأطباق.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
زجاجة تخزين وسائط PYREX بسعة 500 مل	توماس ساينتفيك/كورنينغ	1743E20/1395-500	تستخدم لتذوق الماء.
زجاجات شفط بسعة 500 مل	توماس ساينتفيك/كورنينغ	1234B28/1220-2X	يستخدم لفصل كسور الزيت.
كماشة قاطعة سلكية بقياس 6 إنش	توماس ساينتفيك/ريستيك	1173Y64/23033	يستخدم لقطع شظايا المرجان.
اجار	هيميديا	PCT0901-1 كجم	كان يستخدم لصنع وسائط صلبة.
مرق بوشنيل هاس	هيميديا	M350-500G	يستخدم كوسط أدنى ليتم تعزيزه بمصادر الكربون.
قارورة إيرلنماير	توماس ساينتفيك/DWK علوم الحياة (كيمبل)	4882H35/26500-125	يستخدم لزراعة النقع المرجاني باستخدام خرز زجاجي.
غطاء التدفق الطبقي			كان بحاجة للعمل في ظروف معقمة.
لوريا بيرتاني برق، ميلر (شورق ميلر لوريا بيرتاني)	هيميديا	M1245-1KG	يستخدم كوسيط غني لزراعة البكتيريا.
مارين آجار 2216 (زوبيل مارين آغار)	هيميديا	M384-500G	يستخدم كوسيط غني لزراعة البكتيريا.
حاضنة الهزاز المداري			يستخدم لاحتضان الوسائط السائلة والزيت.
حاضنة الألواح			تستخدم لحضانة الأطباق.
هاون ومدقة من الخزف	توماس العلمي/شركة يونايتد ساينتيفيك سبلايزز	1201U69/JMD150	يستخدم لنقع شظايا المرجان.
الطرد المركزي المبرد			اعتدت على الطرد المركزي لزراعة البكتيريا.
مقياس الطيف الفوتوني			يستخدم لقياس الكثافة البصرية لمزارع البكتيريا.
مجموعة تنقية الحمض النووي الجينومية من ويزارد	بروميغا	A1120	يستخدم لاستخراج الحمض النووي من السلالات الميكروبية.