تتبع نمو البكتيريا بدقة خلية واحدة في نظام ميكروفلويديك

الملخص

المصدر: كابين، م. ت. وآخرون. تحليل الميكروفلويد أحادي الخلية لباسيلوس سبتيليس. J. Vis. Exp. (2018)

يوضح الفيديو استخدام جهاز ميكروفلويديك لمراقبة نمو البكتيريا على مستوى الخلية الواحدة. يعرض كيف يتم تغذية الخلايا البكتيرية غير المتحركة، المحصورة داخل خنادق على نطاق دقيق، بشكل مستمر وتصويرها تحت مجهر فلوري. يتيح هذا الإعداد التصور الفوري لتتبع انقسام الخلايا وتتبع النسب عبر أجيال متعددة.

البروتوكول

1. صب أجهزة PDMS

1. في بيئة خالية من الغبار، اخلط بوليمر بولي ديميثيل سيلوكسان (PDMS) مع عامل التجليد بنسبة 10:1 وإزالة الغاز تحت الفراغ لمدة لا تقل عن 10 دقائق.
2. ضع جهاز سيليكون ماستر (أو نسخة من الإيبوكسي أو البولي يوريثان) على قطعة من ورق الألمنيوم غير المنكسور داخل لوحة بتري من البوليسترين. صب خليط PDMS المزيل من الغازات فوق الأنبوب الرئيسي إلى عمق يقارب 5 مم. قم بإزالة الغازات من لوحة بتري لمدة لا تقل عن 10 دقائق. استخدم تيارا لطيفا من الهواء لكسر الفقاعات السطحية.
   ملاحظه: قد يطفو جزء من النسخة البلاستيكية أثناء إزالة الغازات؛ إذا حدث ذلك، اضغط النسخة المقلدة بجهاز تطبيق بلاستيكي نظيف.
3. قم بتجبير PDMS لمدة ساعة على الأقل في الفرن عند 60 درجة مئوية وبرد إلى درجة حرارة الغرفة. قم بإزالة ورق الألمنيوم الذي يحتوي على اللوحة الرئيسية وPDMS المعالجة من لوحة بيتري. قم بتقشير ورق الألمنيوم من الجزء الخلفي من الماستر بعناية، ثم قم بتقشير PDMS من الماستر بعناية.
   ملاحظه: بدلا من ذلك، يمكن معالجة PDMS طوال الليل في درجة حرارة الغرفة. يمكن التغلب على هشاشة الشريحة الرئيسية من الرقائق باستخدام لاصق الإيبوكسي لربط الرقائق بشكل دائم بقرص ألمنيوم بسماكة 1/16 بوصة بنفس حجم الرقاقة.
4. وبما أن الرقائق عادة ما تحتوي على عدة أجهزة ميكروفلويدية بأبعاد مختلفة قليلا، قم بقص جهاز واحد حسب الحجم باستخدام مشرط نظيف وحاد.
   ملاحظه: للعمل الروتيني على Bacillus subtilis ، استخدم أجهزة تحتوي على خنادق خلوية بعرض 1.0 ميكرومتر.

2. ثقب الجهاز والربط

1. ضع قطعة من شريط المكتب الشفاف (انظر جدول المواد) فوق الجانب المزخرف من الجهاز لتعزيز وضوح الميزات المزخرفة. يتم تحديد منافذ الدخول والمخرج كمناطق دائرية في طرفي القنوات السائلة المرئية (الشكل 1). لتحسين رؤيتها عند ثقب دبابيس المدخل والمخرج، ضع علامات على المداخل والمخارج بنقاط باستخدام قلم رفيع الرأس.
   ملاحظه: لضمان عدم ازدحام دبابيس المدخل والمخرج، يتم ثقب كل قناة ثانية، بدءا من القناة أسفل الرمز الأبجدي للجهاز.
2. اقلب جهاز PDMS بحيث يكون الجانب المنقوش للأسفل، ثم اخترق الجهاز إلى النقاط المحددة باستخدام ثقب خزعة 0.75 مم؛ تخلص من الضربات.
   ملاحظه: يتم ثقب الأجهزة بحيث يكون الجانب المنقوش للأسفل لأن الثقب الناتج عن ثقب الخزعة عادة ما يكون متسعا قليلا عند دخول الثقب إلى البوليمر. ثقب الجهاز في الاتجاه المقلوب يضمن أن يكون للثقب على الجانب المزخرف حافة حادة.
3. باستخدام المجهر المجسم، تأكد من تداخل الثقوب مع مناطق المدخل والمخرج في الجهاز. استخدم ملقطا دقيقا لإزالة أي بقايا زائدة من PDMS من الثقوب المثقبة.
4. استخدم شريط لاصق لإزالة الغبار من جانبي الجهاز ووضعه في لوحة بتري نظيفة من البوليستيرين. حضر زجاجا غطاء بحجم 22 مم × 40 مم عن طريق الترطيب بكحول الأيزوبروبيل 100٪ والفرك بمناديل تنظيف الغرفة؛ يجف بتيار من الهواء الخالي من الغبار أو النيتروجين.
5. ضع ميزة جهاز PDMS المثقوب على الوجه مع زجاج الغطاء المنظف في منظف بلازما الأكسجين.
   1. معالجة الجهاز بالبلازما بالإعدادات التالية: فراغ، 70 mTorr؛ ضغط O₂، 200 mTorr؛ المدة، 15 ثانية؛ الطاقة، 30 واط. مباشرة بعد انتهاء فترة معالجة البلازما، قم بإزالة الجهاز وتغطية الزجاج من منظف البلازما.
   2. قلب جهاز PDMS وضعه في مركز الزجاج الغطاء بحيث يلامس الجانب المزخرف الزجاج؛ تأكد من أن قنوات التغذية (التي تمتد بين منطقة المدخل والمخرج) محاذية مع المحور الطويل لزجاج الغلاف. اضغط برفق شديد لضمان إغلاق PDMS ضد الزجاج.
6. اخبز الجهاز المجمع في فرن لمدة ساعة على الأقل عند درجة حرارة 60 درجة مئوية. بعد الخبز، تحقق يدويا من أن جهاز PDMS مرتبط بالزجاج عن طريق الضغط بلطف على أحد أركان الجهاز.
   ملاحظه: بمجرد ربط الجهاز، يجب استخدامه خلال 24 ساعة، حيث سيصبح البوليمر أكثر كراهية للماء مع مرور الوقت بعد معالجة البلازما.

3. تحضير السباكة بالميكروفلويديك

1. قطع أطوال أنابيب البوليمر (القطر الداخلي (ID) 0.02 بوصة، القطر الخارجي (OD) 0.06 بوصة) بأطوال مناسبة للوصول من مضخة الحقنة إلى جهاز التبديل (إذا تم استخدامه) والجهاز عند تركيبه على المجهر. اقطع أكبر عدد ممكن من المسارات الميكروفلويدية.
2. قم بتجميع وصلات Y لصمامات الضغط (إذا كنت تستخدمها) عن طريق قطع وربط أطوال 2 سم من أنابيب السيليكون المرنة (0.03 بوصة ID، 0.065 بوصة OD) على الشوكة العلوية في "Y" وأطوال 1 سم من أنابيب السيليكون في الشوكة السفلية لل "Y".
3. قطع أطوال 10 سم (أو مناسبة) من أنابيب البوليمر؛ قم بتوصيلها من أحد الأطراف بنقطة التوصيل عن طريق إدخالها في أجزاء أنابيب السيليكون بقطر 1 سم على الشوكة السفلية لخط "Y". قم بتوصيلها في الطرف الآخر بإبر 21G التي أزيل من محولات الحقن البلاستيكية وانحنت تقريبا 90° على بعد حوالي 9 مم من طرف الإبرة.
4. قم بتوصيل إبر 21G الخام إلى أحد طرفي أجزاء الأنابيب التي ستمتد من الحقن إلى جهاز المفتاح عن طريق إدخال الإبر في الأنبوب. أدخل الأطراف الأخرى لكل طول من الأنابيب في أجزاء أنابيب السيليكون على شوكة مدخل وصلات Y.
   ملاحظه: استخدم نوعا من الأجهزة لتثبيت صمامات الضغط والوصلات في مكانها؛ يمكن صنع ذلك بسهولة من صندوق رؤوس ميكروبايبت (الشكل 2D).
5. قطع أطوال أنابيب البوليمر لنقل النفايات من مخرج الجهاز إلى كأس النفايات. وصلها من أحد الأطراف إلى إبر 21-G مثنية محضرة كما هو موضح أعلاه. قم بلصق الطرف الآخر من الأنابيب في كأس نفايات.
6. جهز كميات مناسبة من الوسائط تحتوي على 0.1 ملغ/مل من ألبومين مصل البقر (BSA) واملأ الحجم والعدد المطلوب من الحقن. توصيل الحقن المحملة ب BSA بإبر 21G المحضرة المتصلة بأنبوب السحب وتحميل الحقن في مضخات الحقنة.
   ملاحظه: في التجارب النموذجية، تستخدم 5 قنوات من الجهاز، كل منها مزود بحقنة 20 مل. التجربة التي يتم فيها تبديل الوسط ستتطلب مجموعتين من 5 حقن لكل منها. هنا، يشار إلى المضخة التي تحتوي على الطرف الأول باسم مضخة الطور الأول، والمضخة التي تحتوي على البنك الثاني، مع وسط ما بعد التبديل، تسمى مضخة الطور الثاني.
7. قم بتفريغ الهواء من أنابيب المدخل عن طريق تشغيل مضخات الحقن بمعدل تدفق مرتفع (>500 ميكرولتر/دقيقة)، بدءا بتوجيه مضخات الحقنة عموديا والنقر على الحقن لجلب فقاعات الهواء إلى الأعلى. بمجرد تنقية الهواء من الحقن، ضع مضخة الحقنة أفقيا واضغط تدريجيا على خطوط البوليمر من الحقن عبر جهاز المفتاح لإزالة وتطهير فقاعات الهواء. كرر هذه العملية للمجموعة الثانية من الحقن (إذا كنت تبدل الوسط).
8. بعد تنقية فقاعات الهواء، اضبط مضخة الحقنة ذات الطور الثاني (أي مع الوسط الذي سيستخدم ثانيا، بعد المفتاح) على 1.5 ميكرولتر/دقيقة، ثم أوقف التدفق. ضع مشابك رابطة صغيرة على أجزاء الأنابيب المرنة على فرع وصلات Y المقابلة للطور الوسيط الثاني. استمر في تشغيل مضخة الحقنة ذات الطور الأول بمعدل تدفق معتدل (مثلا 10 ميكرولتر/دقيقة) لمدة لا تقل عن 30 دقيقة لتطهير الوسط الثاني من أنبوب السحب أسفل نقطة التقاء Y.

4. تحضير زراعة الخلايا

1. ننمو ما قبل الزراعة للسلالة المطلوبة في الوسط المطلوب بين عشية وضحاها، إلى المرحلة الثابتة. يجب أن تحتوي السلالة البكتيرية على طفرة تجعل الخلايا غير متحركة، حتى لا تسبح الخلايا خارج قنوات الجهاز.
   ملاحظه: في هذا البروتوكول، السلالة البكتيرية هي B. subtilis 3610 التي تحتوي على استبدال HagA233V (هذه الطفرة تجعل السوط مستقيما بدلا من الحلزوني، مما يمنع حركة الخلية)، ومراسلP rsbV-mNeonGreen لإجهاد الخلية، ومراسل Phyperspank-mNeptune (الأحمر) المكون لتسليط الضوء على الخلايا. يستخدم وسط لينكس لوريا-بيرتاني (LB) في البروتوكول المثالي. تحتوي السلالات النموذجية لتجارب الميكروفلويدكس على واحد أو أكثر من مراسلي النسخ الفلوري وبروتين فلوري سيتوبلازمي منتج بشكل أساسي لتسهيل الكشف الآلي عن الخلايا. لم تلاحظ عيوب النمو عند استخدام وسط LB Lennox الغني، لكن نمو B. subtilis في الأوساط الدنيا قد يتم تثبيط في ظروف ميكروفلويدية لأن السيدروفورات المفرزة تغسل بواسطة تدفق الوسط. في مثل هذه الظروف، يمكن استعادة النمو بإضافة سترات الصوديوم وكلوريد الحديديك إلى الوسط، كما هو موضح في وسط S750.
2. في صباح يوم التجربة، قم بتخفيف خلايا B. subtilis بنسبة 1:50 إلى قارورة محشوشة بسعة 250 مل تحتوي على 25 مل من وسط النمو. نما الخلايا لمدة 5 إلى 6 ساعات في زراعة الاهتزاز عند 37 درجة مئوية حتى تصل إلى كثافة بصرية تزيد عن 1.
   ملاحظه: الزراعة الكثيفة للخلايا مفضلة لأن خلايا B. subtilis الثابتة أصغر حجما وأقل شيوعا في سلاسل الخلايا، مما يسهل تحميل الأجهزة. قد تحتاج أنواع بكتيرية مختلفة إلى وسط أو ظروف نمو أخرى لتحمل مثالي.
3. باستخدام حقنة مزودة بفلتر بحجم مسام بحجم 5 ميكرومتر، قم بترشيح حوالي 15 مل من زراعة الخلايا إلى أنبوب مخروطي بحجم 15 مل لإزالة سلاسل خلايا B. subtilis (وهو غير ضروري للإشريكية القولونية وقد لا يكون ضروريا مع أنواع أخرى).
   ملاحظه: يجب إزالة عدد قليل نسبيا من الخلايا؛ يجب أن يكون الترشيح عكرا.
4. قم بجهاز الطرد المركزي في الثقافة المفلترة لمدة 10 دقائق عند حرارة 4000 × جرام في درجة حرارة الغرفة. اصب الفائق وأعد تعليق حبيبات الخلية في السائل الفائق المتبقي في الأنبوب، مع إضافة حوالي 500 ميكرولتر من الوسط الطازج إذا لزم الأمر لتسهيل توصيل الأنبوب لتعليق الخلية.

5. تحميل الجهاز

1. ضع برفق رؤوس المايكرو بايبت الرقيقة المحملة بالهلام (انظر جدول المواد) في فتحات مخرج الجهاز الميكروفلويد.
2. باستخدام رؤوس رقيقة تحمل الجل مع ميكروبايبت P200، قم بتحويل الجهاز إلى السحب عن طريق حقن وسط يحتوي على 1 ملغ/مل BSA في فتحات المدخل، مع مراقبة الأطراف في فتحات المخرج لمراقبة ملء قنوات الميكروفلويديك (الشكل 2A). حضن الجهاز في درجة حرارة الغرفة لمدة تقارب 5 دقائق.
   ملاحظه: يستخدم BSA عادة كعامل حجب أو سلبي يرتبط بالسطح الكاره للماء لبوليمر PDMS، مما يزيد من محبته للماء ويقلل من ارتباط البروتينات أو الخلايا الأخرى (عبر جزيئات سطح الخلية).
3. باستخدام رؤوس رقيقة لتحميل الجل، قم بتحميل كل قناة بالخلايا المعلقة (من القسم 4)، باستخدام الأطراف في قناة المخرج لمراقبة تقدم الخلايا عبر الجهاز (الشكل 2B).
   ملاحظه: يتم تسهيل التحميل بضبط ميكروبايبت P200 على أقصى حجم لها وهو 200 ميكرولتر ثم شفط وسادة من الهواء قبل شفط حجم صغير (حوالي نصف حجم الجزء الرقيق من طرف الماصة) من الخلايا. لا يجب أن يكون حجم الخلايا المعلقة دقيقا، لأن حجم جهاز PDMS صغير مقارنة بحجم الميكروبايبت. لا نعرف عن حد أعلى لكثافة الخلايا المعلقة، طالما يمكن إدخال تعليق الخلية إلى الجهاز. يمكن أن تسد كتل الخلايا الجهاز ويجب تجنبها بالتفريغ الكامل و/أو خلط الدوامات.
4. قم بإزالة رؤوس تحميل الجل من فتحات المخرج برفق، والعمل على طريقة واحدة لمنع تلف الجهاز.
5. قم بطرد المركزي بالجهاز في جهاز طرد مركزي دقيق على سطح طاولة في محول دوار مناسب بقوة تقارب 6,000 × g لمدة 10 دقائق (الشكل 2C).
   ملاحظه: تم استخدام محول دوار ألمنيوم مصمم خصيصا ليتناسب مع دوار الطرد المركزي الدقيق (الشكل 2C)؛ قد تستخدم نماذج مختلفة من الطرد المركزي مع محولات دوار مناسبة. الميزة المهمة للمحول هي أنه يوفر قوة جانبية في اتجاه نهايات خنادق الخلية المغلقة، مما يجبر الخلايا على الدخول إلى القنوات الجانبية.
6. تحقق من نجاح التحميل تحت المجهر (الشكل 3)، ولكن دون تثبيت الجهاز على حامل الشريحة/إدخال المرحلة.
   ملاحظه: في هذا البروتوكول، يستخدم هدف غمر الزيت بقيمة 60X و1.4 NA و Ph3 للتحقق في هذه المرحلة والتصوير اللاحق.

6. تجميع الجهاز، التوازن، والتركيب

1. قم بتثبيت الجهاز المحمل بعناية على إدخال المسرح عن طريق لصق زجاج الغطاء على جانبي جهاز PDMS في أسفل إدخال المسرح (أي عكس إدخال المسرح قبل تثبيت الجهاز). اقلب مجموعة جهاز إدخال المسرح بحيث يكون جهاز PDMS مواجها للأعلى وضعه على سطح ناعم، مثل مسح خال من الغبار (الشكل 2D).
2. اضبط معدل تدفق مضخة الحقنة الطور-1 إلى 35 ميكرولتر/دقيقة. عند العمل مع مسار واحد في كل مرة، أدخل إبرة الإدخال ثم إبرة المخرج (أي تمتد إلى كأس النفايات؛ الشكل 2E).
3. امسح أي وسط زائد بمسح نظيف وخالي من الغبار وافحص الجهاز بصريا بحثا عن التسريبات. افحص أنبوب المخرج بحثا عن ظهور الخلايا الزائدة (عادة ما تظهر كشريط عكر) والغضروف الهلالي المتوسط، الذي يتحرك ببطء نحو كأس النفايات.
4. اسمح للجهاز بالعمل بسرعة 35 ميكرولتر/دقيقة لمدة تقارب 15 إلى 30 دقيقة، حتى تصرف جميع المسارات المتصلة إلى كأس النفايات.
5. اضبط مضخة الحقنة الطور-1 على 1.5 ميكرولتر/دقيقة وأوقف التدفق. أحضر المضخة والجهاز بالكامل إلى المجهر (يتم المساعدة في هذه العملية بوضعها كلها على عربة متحركة) وأعد تشغيل تدفق الوسط من الطور الأول بسرعة 1.5 ميكرولتر/دقيقة. قم بتثبيت إدخال المرحلة مع الجهاز بعناية على مجهر فلوري مقلوب، باستخدام الشريط اللاصق حسب الحاجة لتوجيه أنابيب المدخل والمخرج.
6. حدد المواقع المطلوبة على الجهاز للتصوير وابدأ التصوير كما هو مطلوب. لاحظ أن الخلايا عادة ما تحتاج إلى بضع ساعات (حوالي 10 أجيال) للوصول إلى نمو طور أسي في الحالة المستقرة، وقد يتأخر بدء التقاط الصورة حسب الرغبة بحيث يبدأ التصوير بعد فترة التوازن.
   ملاحظه: يجب التحقق من النمو الثابت للخلايا في الطور الأسي خلال تحليل الصور اللاحق من خلال تتبع أوقات انقسام الخلايا والتأكد من أنها وصلت إلى قيمة دنيا ثابتة.

النتائج

الشكل 1: مخطط جهاز الميكروفلويد. يتم عرض مخطط الجهاز تقريبا بالحجم. يتم تسمية الرمز الأبجدي مع مناطق المدخل والمخرج التي يتم ثقبها لربط الإبر ذات الأطراف غير الحادة. عادة ما تستخدم نصف القنوات المزخرفة (مظللة بالرمادي). خنادق الخلايا موجهة ...

المواد