$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. ظروف زراعة البكتيريا
- عند العمل تحت غطاء تدفق طبقي، استخدم 100 ميكرولتر من مخزون الجلسرول من بروتين فلوري أخضر (GFP) وموسوم ب Pseudomonas putida KT2440 (1 ×10 7 مل-1، مخزن عند -80 درجة مئوية) لتطعيم 5 مل من وسط لوريا-بيرتاني (LB). الحضانة عند 30 درجة مئوية مع الرج عند 250 دورة في الدقيقة طوال الليل.
- في اليوم التالي، أعد تعليق 100 ميكرولتر من الزراعة الليلية في وسط 5 مل رطل واحتضن تحت نفس الظروف لمدة 5 ساعات (المرحلة الأسية). أخذ عينات من أليكوت بسعة 1 مل في أنبوب بسعة 2 مل، واتركه يبرد حتى درجة حرارة الغرفة (~15 دقيقة)، ثم استخدم الطرد المركزي (2300 × جرام لمدة 5 دقائق).
- أزل السوبرناتينت وأضف 1 مل من مخزن الحركة إلى الحبيبة. دوامة لفترة وجيزة لتحاثيم العينة. يتم تخفيفها للوصول إلى تركيز الخلية المطلوب، مثل 5 × 105 مل-1.
- للتجارب التي تشمل مجتمعات طبيعية، مثل تلك المشتقة من الجداول، جهز وسيطا للزراعة غير الانتقائية. على سبيل المثال، استخدم مياه الجداول المصفى والمعقمة أو وسط مياه الجدول الصناعي المعدل بمصدر كربوني معقد (وسط LB).
2. تحضير جهاز ميكروفلويديك في بولي ديميثيل سيلوكسان (PDMS)
- صمم الهندسة المسامية المطلوبة باستخدام برنامج الرسم بمساعدة الحاسوب (CAD)، والذي يتكون من مصفوفة من الدوائر (أي العائق غير النفاذ أمام التدفق)، موصوفة بحجم نصف القطر وإحداثيات المركز.
ملاحظة: مثال على هندسة مسامية ذات أحجام حبيبات ومسام عشوائية مقدم في الشكل 1A. قناة المراقبة الخالية من العوائق بالقرب من المخرج تسهل اكتساب منحنيات اختراق (BTCs). - استنادا إلى الهندسة المختارة، جهز قالبا باستخدام الفوتوليثوغرافيا القياسية SU-8.
ملاحظة: بدلا من ذلك، يمكن أيضا طلب القوالب من منشأة متخصصة للتصنيع الدقيق. للحصول على تدفق سائل غير متجانس في المستوى الأفقي، من المهم تصميم سمك غرفة الميكروفلويدكس بنفس حجم متوسط حجم حلق المسام. ومع ذلك، تأكد من أن أبعاد جهاز الميكروفلويديك مناسبة للملاحظة تحت المجهر (مثل العمل على شرائح المجهر). - جهز 50 جراما من PDMS بإضافة 10٪ من الرابط المتقاطع (ثنائي ميثيل، ميثيل هيدروجين سيلوكسان كوبوليمر) إلى 90٪ من الإيلاستومر بالوزن، باستخدام حقنة بدون إبرة. اعمل في ظروف نظيفة وتجنب الغبار قدر الإمكان. اخلط الكاشفين في وعاء نظيف وقابل للتخلص من مرة واحدة وطبق التفريغ (100 مللي بار) لمدة 30 دقيقة لإزالة الهواء المذاب والفقاعات من جهاز PDMS اللزج.
- ضع القالب في طبق بتري (قطره 100 مم، ارتفاعه 15 مم). صب PDMS على القالب إلى الارتفاع المطلوب (مثلا 2-5 مم). غط طبق البتري وابقه على درجة حرارة 60 درجة مئوية لمدة 4 ساعات (طوال الليل لطبقات أكثر سماكة) حتى يتصلى.
ملاحظة: لأغراض التصور، يجب أن يكون الضوء قادرا على المرور عبر نظام PDMS؛ لذا، فإن طبقة رقيقة بين 2 مم إلى 5 مم مرغوبة. الطبقات السميكة (>5 مم) تقلل من شفافية الجهاز، والطبقات الأرفع تتعرض للتشوهات أثناء التطبيق. - أزل القالب من الفرن ودع الجهاز الميكروفلويديك يبرد إلى درجة حرارة الغرفة. بمجرد أن يبرد، قم بإزالة الجزء المطلوب من PDMS بعناية باستخدام مشرط.
ملاحظة: الضغوط القوية على العفن تؤدي إلى تشققات العفن. لا تلمس جهاز PDMS بيديك العاريتين، لأن البصمات ستؤثر على الشفافية البصرية. - قم بإغلاق أسفل قناة PDMS مؤقتا (حيث تم نقش الهندسة المطلوبة) بشريط لاصق. باستخدام مثقب خزعة بقطر 0.5 مم، اخترق قناة الميكروفلويديك لإنشاء مدخل ومخرج يناسب أنبوب 0.5 مم (القطر الداخلي).
ملاحظة: الطبيعة الناعمة لأجهزة PDMS ستضمن إحكام التثبيت بمجرد إدخال الأنبوب. لا يمكن إنشاء قنوات المدخل والمخرج بعد أن يتم إغلاق PDMS على الزجاج. - إغلاق قناة الميكروفلويدية عبر ربط بلازما الأكسجين باستخدام مولد التردد العالي (رابط البلازما، جدول المواد). لهذا، نظف شريحة زجاجية سيليكية (25 مم × 75 مم) بالإيثانول واتركها تجف. أزل الشريط من قناة PDMS وضع القناة بحيث يكون الجانب المسامي مواجها للأعلى. عالج شريحة زجاج السيليكات وأسطح PDMS بالبلازما لمدة حوالي 45 ثانية في درجة حرارة الغرفة.
- ضع قناة PDMS على شريحة زجاجية سيليكية وسخنها على حرارة 100 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة على صفيحة ساخنة.
- أزل جهاز الميكروفلويديك من صفيحة التسخين وبردها إلى درجة حرارة الغرفة. اربط مدخل قناة PDMS بأنابيب التوصيل (أنبوب التوصيل). ضع تفريغ كهربائي لمدة 30 دقيقة لإزالة الهواء من PDMS، الذي يكاد يكون غير منفذ للسوائل لكنه نفاذ للغاز.
- جهز 100 مل من محلول الحركة (10 ملليموتر فوسفات البوتاسيوم، 0.1 ملليمول إيثيلين ديامين رباعي أسيتيك حمض (EDTA)، مع 1٪ مع جلوكوز/فولت، درجة حموضة 7.0) وحقن 1 مل منه في جهاز الميكروفلويديك باستخدام مضخة حقنة تعمل بقدرة 10 ميكرولتر على الأقل 1.
ملاحظة: بما أن PDMS أقل مشبعا في الغاز (بسبب خطوة التفريغ السابقة)، ستختفي الفقاعات خلال ~30 دقيقة.
3. تحليل نقل البكتيريا باستخدام أجهزة PDMS الميكروفلويدية
- ضع جهاز PDMS الميكروفلويديك المشبع سابقا بمخزن الحركة على مرحلة المجهر. استخدم الشريط اللاصق لتثبيت الأنبوب لتقليل اضطراب التدفق أثناء حركة المسرح.
- انقل مرحلة المجهر إلى قناة المراقبة القريبة من المخرج. باستخدام المجهر الساطع أو تباين الطور، ركز على مركز قناة المراقبة واضبط التكبير لرؤية الخلايا البكتيرية الفردية.
- قم بتغيير إعدادات مسار الضوء إلى مجهر الفلورة وضبط وقت التعرض للكاميرا لتفكيك الخلايا البكتيرية الفردية (مثلا 100 مللي ثانية)، أو بحيث تكون إشارات التألق للخلايا أقوى بثلاث مرات على الأقل من الضوضاء الخلفية.
- بعد ذلك، أدخل أنبوب السحب في أنبوب بحجم 2 مل يحتوي على التعليق البكتيري. اعكس اتجاه المضخة وابدأ بسحب نظام التعليق بمعدل تدفق 1 ميكرولتر في الدقيقة 1.
- مسح المقطع العرضي لقناة المراقبة بالكامل، مسجلا صورة مركبة كل دقيقتين، على مدار مدة التجربة بأكملها.
