نقل نظام تعبير جيني محفز إلى خلايا تعبر عن بروتين مؤثر بكتيري

الملخص

المصدر: بيرينز، سي. وآخرون. تطبيق نظام تعبير محفز لدراسة تداخل عوامل الضراوة البكتيرية مع الإشارات داخل الخلية. J. Vis. Exp. (2015)

يوضح هذا الفيديو استخدام نظام تعبير محفز لتحديد المكان الذي يتسبب فيه بروتين المؤثر البكتيري CaeB في تسريع الموتمة المضيفة. يوضح الخطوات اللازمة لتحويل الخلايا المعبرة عن CaeB بنظام يستجيب للتتراسيكلين لتحفيز التعبير الجيني المؤيد للأبوبوتوز بهدف تحديد نقطة الاضطراب داخل السلسلة.

البروتوكول

1. تحويل خط الخلايا المستقر باستخدام نظام متجه التعبير القابل للتحفيز

1. بذور الكلى الجنينية البشرية (HEK)293 خلية تعبر بشكل مستقر عن بروتين فلوري أخضر (GFP) أو GFP-CaeB في صفيحة مكونة من 12 بئر بكثافة 1 ×^{10 5} خلايا/بئر.
2. بعد 19 ساعة من البذر، قم بتوصيل الخلايا مع البلازميد المنظم وبلازميد الاستجابة، إما بترميز باكس أو الكاسبيز المنشط 3.
   1. تشارك خلايا HEK293 المستقرة مع 100 نانوغرام من بلازميد منظم pWHE125-P (الشكل 1) و100 نانوغرام من بلازميدات الاستجابة pWHE655-hBax أو pWHE655-revCasp3 (الشكل 2) و0.4 ميكرولتر من البولي إيثيلينامين.
   2. حضر مادة حمض الديوكسي ريبونوكليك (DNA) وكاشف نقل الإيثيلينامين لكل منهما في 75 ميكرولتر من وسط أوبتي-ميم وحضن لمدة 5 دقائق بالضبط في درجة حرارة الغرفة (RT). لتكوين المعقد، حضن كلا الخليطين معا لمدة 15 دقيقة عند RT.
3. أضف محلول البولي إيثيلينين/الحمض النووي بشكل أسفل إلى الخلايا وحضن عند 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد الكربون_.

2. تحفيز الاستمات المبرمج

1. بعد 5 ساعات من النقل، تحفز التعبير عن البروتينات المؤيدة للاستبومات بإضافة 1 ميكروغرام/مل دوكسيسيكلين إلى وسط الزراعة. احتضن الخلايا لمدة 18 ساعة عند 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد الكربون_2.

النتائج

الشكل 1. نظرة مخططية على البلازميد التنظيمي pWHE125. العناصر الأساسية للتكاثر في البكتيريا، بما في ذلك مصدر التكاثر (ori pBR) وشريط مقاومة للمضادات الحيوية ضد الأمبيسيلين (Amp^R)، وللتعبير عن منظمات التيت-ترانسلي، مثل المنشط/...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
DMEM	تقنيات الحياة	31966-021
FCS	بيوكروم	S0115
القلم / العقدية	تقنيات الحياة	15140-122
أوبتي مم	تقنيات الحياة	51985
إكس-تريم جين 9	روش	6365752001
البولي إيثيلينيمين	البوليسيينس	23966
الدوكسيسيكلين	سيغما ألدريتش	D9891