الكشف عن تعبير الإنزيم المستهدف في الخلايا البكتيرية المعدلة وراثيا

الملخص

المصدر: كيم، ه. وآخرون، الفحص متعدد الإنزيمات باستخدام نظام فحص إنزيمات جينية عالي الإنتاجية. J. Vis. Exp. (2016)

يوضح هذا الفيديو طريقة فحص جيني للكشف عن تعبير الإنزيمات باستخدام مكتبات فوسميدات ميتاجينومية وركائز كروموجينية. يحدد التدفق الخلوي ويعزل الخلايا المفردة المنتجة منتجات ملونة، مما يتيح اختيار عالي الإنتاجية للخلايا النشطة المعبرة عن الإنزيمات.

البروتوكول

1. إعداد مكتبة الميتاجينوميك بنظام فحص إنزيمات جينية لاكتشاف p-nitrophenol (pNP) (pNP-GESS)
   1. إنشاء مكتبة ميتاجينومية في الإشريكية القولونية باستخدام ناقل الفوسميد باستخدام مجموعة إنتاج مكتبة الفوسميد.
   2. Aliquot 100 ميكرولتر من المكتبة للتخزين عند −70 درجة مئوية، وهو مصدر لخلايا المكتبة الميتاجينومية.
      ملاحظه: الكثافة البصرية لعينة تقاس عند طول موجي 600 نانومتر (OD₆₀₀) من هذا المخزون المكتبي هي تقريبا 100.
   3. قم بإذابة 100 ميكرولتر من مكتبة الميتاجينومية المخزنة على الثلج وتلقيح في قارورة بحجم 500 مل تحتوي على 50 مل من لوريا-بيرتاني (LB) و12.5 ميكروغرام/مل كلورامفينيكول، تليها حضانة بحرارة 37 درجة مئوية لمدة ساعتين.
   4. اجمع الخلايا في أنبوب مخروطي بحجم 50 مل عن طريق الطرد المركزي بقوة 1000 × جرام لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
   5. أعد تعليق الحبيبة بسرعة في ماء مقطر مثلج بسعة 50 مل (DW) وجهاز طرد مركزي عند 1,000 مرة جم لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية مرة أخرى.
   6. أعد تعليق الحبيبة في 50 ميكرولتر من الماء البارد جدا مع 10٪ (v/v) من الجلسرون. استخدم 50 ميكرولتر من هذا الخلية للتقميم الكهربائي.
   7. ضع خليط الخلايا الكهربائية 50 ميكرولتر وحمض نووي pGESS(E135K) (100 نانوغرام) في كوفيت كهربائي بارد جدا وقم بتركيب الخليط بقوة كهربائية (1.8 كيلوفولت/سم، 25 ميكروفهرايت).
   8. أضف بسرعة 1 مل من المرق المثالي جدا مع وسط كبت الكاتابوليت (SOC) وأعد تعليق الخلايا بلطف.
   9. انقل الخلايا إلى أنبوب دائري قاع بسعة 14 مل باستخدام ماصة وحضن على حرارة 37 درجة مئوية لمدة ساعة.
   10. انشر 500 ميكرولتر من الخلايا المستردة على صفيحة مربعة LB بحجم 20 × 20 سم تحتوي على 12.5 ميكروغرام/مل كلورامفينيكول و50 ميكروغرام/مل أمبيسيلين. حضن الطبق على حرارة 30 درجة مئوية لمدة 12 ساعة.
   11. قم بكشط المستعمرات باستخدام مكشطة الخلايا واجمع الخلايا في أنبوب مخروطي بحجم 50 مل باستخدام وسائط تخزين خلية باردة جدا.
   12. الطرد المركزي عند 1,000 × جرام لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية. أعد تعليق الحبيبة في وسط تخزين خلية باردة بحجم 10 مل للوصول إلى OD₆₀₀ من 100.
   13. أليكوت 20 ميكرولتر من الخلايا للتخزين عند −70 درجة مئوية.
        
2. إزالة الإيجابيات الكاذبة من مكتبة الميتاجينومية
   1. قم بإذابة الخلايا المكتبية الميتاجينومية الأصلية (من الخطوة 1.13) التي تحتوي على فوسميد الحمض النووي الميتاجينومي وpGESS(E135K) على الجليد.
   2. تلقيح 10 ميكرولتر من الخلايا في 2 مل رطل يحتوي على 50 ميكروغرام/مل أمبيسيلين و12.5 ميكروغرام/مل كلورامفينيكول في أنبوب دائري قاع بسعة 14 مل. حضانة عند 37 درجة مئوية مع الرج عند 200 دورة في الدقيقة لمدة 4 ساعات.
   3. في الوقت نفسه، قم بتشغيل جهاز فرز الخلايا المفعل بالفلورة (FACS) وافتح برنامج FACS الافتراضي. استخدم الإعدادات التالية: قطر طرف الفوهة، 70 ميكرومتر؛ حساسية منطقة التشتت الأمامية (FSC-A)، تضخيم لوغاريتمي 300 V؛ حساسية منطقة التشتت الجانبي (SSC-A)، تضخيم لوغاريتمي 350 V؛ حساسية منطقة فلوريساين إيزوثيوسيانات (FITC-A)، تضخيم 450 V-logarithmic; معامل العتبة، قيمة FSC-A 5.
      ملاحظه: يتم إعطاء الإعدادات النموذجية لجهاز FACS المذكور في جدول المواد. قم بضبط الإعدادات لأجهزة FACS الأخرى.
   4. تخفيف خلايا المكتبة الميتاجينومية من الخطوة 2.2 بإضافة 5 ميكرولتر من العينة إلى أنبوب دائري قاع بحجم 5 مل يحتوي على 1 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS).
   5. ضع عينة المكتبة المخففة على منفذ التحميل لأداة FACS وانقر على زر التحميل في لوحة تحكم الاكتساب لبرنامج FACS.
   6. قم بضبط معدل الأحداث إلى 1,000 - 1,500 حدث/ثانية عن طريق النقر والتحكم في أزرار معدل التدفق في لوحة التحكم.
   7. إنشاء مخطط تشتت FSC-A مدرج للسجل مقابل SSC-A بمقياس لوغاريتمي على ورقة عمل عامة بالنقر على زر Dot Plot في شريط الأدوات. قم بضبط بوابة التشتت R1 لتشمل أحداث الفرد (مجموعة البكتيريا) باستخدام زر بوابة المضلعات في شريط الأدوات.
   8. رسم مخطط مدرج بياني يحتوي على عدد الخلايا مقابل FITC-A المدرج باللوغاريتمية في ورقة العمل بالنقر على زر المخطط التكراري. ثم قم بضبط جهد FITC من تبويب إعدادات جهاز قياس الخلايا في نافذة التحكم بالمفتش بحيث يكون ذروة التوزيع على شكل جرس أقل من 10² من FITC-A.
   9. أنشئ FSC-A بمقياس لوغاريتمي مقابل مخطط سجل FITC-A بالنقر على زر مخطط النقاط في ورقة العمل العامة. قم بتعيين بوابة الفرز R2 على الرسم باستخدام زر بوابة المضلعات في شريط الأدوات بحيث تقع البوابة بين خلايا +5٪ و-5٪ من مركز التوزيع (أي إجمالي 10٪ خلايا حول قمة منحنى الجرس).
   10. ضع أنبوب جمع يحتوي على 1.2 مل LB يحتوي على 50 ميكروغرام/مل أمبيسيلين و12.5 ميكروغرام/مل كلورامفينيكول عند مخرج جهاز FACS وفرز 10⁶ خلايا تلبي كل من بوابات R1 و R2.
   11. أزل أنبوب الجمع، والغطاء، والدوامة بلطف.
        
3. فحص الإنزيمات الميتاجينومية
   1. حضن الخلايا المفترزة (من الخطوة 2.11) عند 37 درجة مئوية مع هز عند 200 دورة في الدقيقة حتى يصل OD₆₀₀ إلى 0.5.
   2. أضف محلول حث نسخ بسعة 1 ميكرولتر لتضخيم عدد نسخ الحثارة داخل الخلية. حضن الخلايا لمدة 3 ساعات إضافية عند 37 درجة مئوية مع هز عند 250 دورة في الدقيقة.
   3. لتحضير الخلايا للفرز، أضف 0.5 مل من الخلايا المزروعة وركيزة مناسبة (أسيتات p-نيتروفينيل، p-نيتروفينيل-β-دي-سيلوبيوسيد، أو فوسفات فينيل) في أنبوب دائري قاع بسعة 14 مل بتركيز نهائي 100 ميكرومول.
      1. للحصول على عينة تحكم، أضف 0.5 مل من الخلايا المزروعة من الخطوة 3.2 إلى أنبوب دائري قاع بحجم 14 مل. أضف نفس حجم PBS مثل حجم الركيزة في الخطوة 3.3.
   4. حضن العينتين عند 37 درجة مئوية مع هز على 200 دورة في الدقيقة لمدة 3 ساعات.
   5. وفي الوقت نفسه، جهز جهاز FACS بنفس تكوينات Step 2.3.
   6. أضف 5 ميكرولتر من الخلايا (للفرز) والخلايا الضابطة إلى أنبوبين دائريين قاعيين بحجم 5 مل يحتويان على 1 مل من PBS على التوالي.
   7. ضع الأنبوب الذي يحتوي على خلايا التحكم على منفذ التحميل في FACS وانقر على زر التحميل في لوحة تحكم الاستحواذ لبرنامج FACS. قم بضبط معدل الأحداث إلى 1,000 - 3,000 حدث/ثانية عن طريق التحكم في أزرار معدل التدفق في لوحة التحكم.
   8. أنشئ مخطط تشتت FSC-A بحجم سجل اللوغاريتمي مقابل SSC-A المدرج بالسجل بالنقر على زر مخطط النقاط في ورقة العمل العالمية للبرنامج، وضبط بوابة التشتت R1 لتشمل أحداث السينجل (السكان البكتيريين) باستخدام زر بوابة المضلعات في شريط الأداة.
   9. أنشئ مخطط تشتت FSC-A بمقياس لوغاريتمي FSC-A مقابل FITC-A بمقياس لوغاريتمي بالنقر على زر Dot Plot في ورقة العمل، وقم بتعيين بوابة فرز R2 على المخطط باستخدام زر بوابة المضلعات في شريط الأدوات بحيث يتم اكتشاف أقل من 0.1٪ من الخلايا السالبة داخل بوابة R2.
   10. استبدل أنبوب عينة التحكم بأنبوب عينة الفرز، وضبط معدل الحدث إلى 1,000 - 3,000 حدث/ثانية عن طريق التحكم في أزرار معدل التدفق على لوحة القيادة.
   11. ضع أنبوب جمع يحتوي على 0.5 مل LB عند مخرج جهاز FACS وفرز 10^{خلايا 4} تلبي بوابات R1 و R2.
       ملاحظه: يمكن أن يتراوح معيار الفرز من أعلى 0.1٪ إلى 5٪ من FITC-A في بوابة R2. في هذا البروتوكول، تم جمع أعلى 1٪ من الخلايا كنتائج إيجابية.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
كوبي كونترول.	مَرْكَز	CCFOS110	مجموعة إنتاج مكتبة فوسميد
محلول الحث CopyControl	مَرْكَز	CCIS125	محلول استقراء النسخ بفوسميد
EPI300	مَرْكَز	EC300110	الخلية الكهروبوتافية
pCC1FOS	مَرْكَز	CCFOS110	متجه الفوسميد
نابض جيني Mxcell	بيو-راد		كوفيت الاختراقية ونظام الحصان الكهربائي
فاكساريا III	بيكتون ديكنسون		قياس التدفق الخلوي (آلة FACS)
AZ100M	نيكون		مجهر
ألترا سليم	المايستروجين		منير LED
أنبوب مخروطي بحجم 50 مل	بي دي فالكون
أنبوب دائري قاع بسعة 14 مل	بي دي فالكون
أنبوب دائري قاع بسعة 5 مل	بي دي فالكون
فوسفات P-نيتروفينيل	سيغما-ألدرتش	N7653	الركيزه
بي-نيتروفينيل β-دي-سيلوبيوسيد	سيغما-ألدرتش	N5759	الركيزه
بي-نيتروفينيل بوتييلات	سيغما-ألدرتش	N9876	الركيزه
لوريا-بيرتاني (ظهير خطي)	بي دي ديفكو	244620	تريبتون 10 جرام/لتر، مستخلص الخميرة 5 جرام/لتر، كلوريد الصوديوم 10 جرام/لتر
المرق المثالي جدا (SOB)	بي دي ديفكو	244310	تريبتون 20 جرام/لتر، مستخلص الخميرة 5 جرام/لتر، كلوريد الصوديوم 0.5 جرام/لتر، كبريتات المغنيسيوم 2.4 جرام/لتر، كلوريد البوتاسيوم 186 ملغ/لتر
مرق فائق الأمثل مع كبت الكاتابوليت (SOC)		الرب، 0.4٪ جلوكوز
مستخلص الخميرة مرتين تريبتون (2xYT)	بي دي ديفكو	244020	هضم البنكرياس من الكازين 16 جرام/لتر، مستخلص الخميرة 10 جرام/لتر، مستخلص الخميرة 5 جرام/لتر
وسائط تخزين الخلايا			مرق يوتيوب 2، 15٪ جلسرول، 2٪ جلوكوز
pGESS(E135K)			ناقل DNA يحتوي على جينات dmpR وegfp مع محفزاتها المناسبة، RBS، والمهتم البندقي. راجع المرجع رقم 5 في المخطوطة لمزيد من التفاصيل.
الكلورامفينيكول	سيغما	C0378
الأمبيسيلين	سيغما	A9518
BD FACSDiva	بيكتون ديكنسون		برنامج قياس التدفق الخلوي إصدار 7.0
برنامج تلفزيوني	جيبكو	70011-044	0.8٪ NaCl، 0.02٪ KCl، 0.0144٪ فوسفات ثنائي الصوديوم، 0.024٪ فوسفات أحادي البوتاسيوم، درجة حموضة 7.4