في المختبر نموذج الزراعة الدفعية لمحاكاة تخمير القولون بواسطة ميكروبيوتا الأمعاء البشرية

الملخص

المصدر: أحمدي، س. وآخرون. نموذج الزراعة الدفعية في المختبر لتقدير تأثيرات الأنظمة التدخلية على ميكروبيوم البراز البشري. J. Vis. Exp. (2019).

يوضح هذا الفيديو طريقة لنمذجة التخمير الميكروبي في الأمعاء عن طريق حضنة عينات البراز بألياف قابلة للتخمير الغذائية تحت ظروف لاهوائية لدراسة إنتاج المستقلبات بواسطة ميكروبيوم الأمعاء.

البروتوكول

تم تنفيذ جميع الإجراءات المتعلقة بجمع العينات وفقا لإرشادات معهد جمع العينات (IRB).

أنذر: استشر أوراق بيانات سلامة المواد المناسبة واتبع التعليمات والإرشادات اللازمة للتدريب المناسب للسلامة البيولوجية المستوى 2 (BSL-2). اتبع جميع خطوات الزراعة وفقا لقواعد السلامة الحيوية القياسية واستخدم خزانة BSL-2 باستخدام ظروف معقمة. علاوة على ذلك، قد تكون عينات البراز من نماذج مختلفة وأشخاص من البشر معرضين لخطر محتمل لانتشار الأمراض المنقولة بالميكروبات. اطلب المساعدة الطبية فورا في حال حدوث أي إصابة أو عدوى. بالإضافة إلى ذلك، يجب الموافقة على استخدام عينات البراز البشري والحيواني من خلال لجان أخلاقية مؤسسية ويجب أن يتوافق مع بروتوكولات استخدام العينات ومعلومات الموضوع.

1. إعداد الإعلام الثقافي

1. إعداد وسائل الثقافة، وتحضير تسعة أنواع من حلول الأسهم:
   1. المحلول A (1,000 مل): إذابة 5.4 جرام من كلوريد الصوديوم (NaCl)، 2.7 جرام من فوسفات ديهيدروجين البوتاسيوم (KH₂PO₄)، 0.16 جرام من ديهيدرات كلوريد الكالسيوم (CaCl 2.2H ₂O)، 0.12 جرام من كلوريد المغنيسيوم سداسي (MgCl_{2.6H 2}O)، 0.06 جرام من رباعي هيدريد كلوريد المنغنيز (MnCl_{2.4H 2}O)، 0.06 جرام من سداسي هيدرات كلوريد الكوبالتوس (CoCl_{2.6H 2}O)، و5.4 جرام من كبريتات الأمونيوم (NH₄)2SO₄، في المياه منزوعة الأيونات ليصل الحجم الكلي إلى 1000 مل.
   2. المحلول B (1,000 مل): إذابة 2.7 جرام فوسفات البوتاسيوم الهيدروجين (K₂HPO₄) في ماء منزوع الأيونات ليصل الحجم الكلي إلى 1000 مل.
   3. محلول معدني نادر (1,000 مل): إذابة 500 ملغ من ثنائي الصوديوم إيثيلين ديامين-تترا أسيتات ديهيدرات (Na₂EDTA)، 200 ملغ من كبريتات الحديد الهيبتاتويدات (FeSO 4.7H ₂O)، 10 ملغ من كبريتات الزنك هيبتاهيدرات (ZnSO_{4.7H 2}O)، 3 ملغ من رباعي هيدريت كلوريد المنغنيز(II) (MnCl_{2.4H 2}O)، 30 ملغ من حمض الفوسفوريك (H₃PO₄)، 20 ملغ من CoCl_{2.6H 2}O، 1 ملغ من ديهيدرات كلوريد الكوب (CuCl_{2.2H 2}O)، 2 ملغ من كلوريد النيكل (II) سداسي هيدرات (NiCl_{2.6H 2}O) و3 ملغ من موليبدات الصوديوم ثنائي هيدرات (Na₂MoO_{4.2H 2}O) في الماء منزوع الأيونات ليصل الحجم الكلي إلى 1000 مل.
      ملاحظه: هذا المحلول حساس للضوء، لذا تأكد من تخزينه في أنابيب/زجاجات مغلفة بالألمنيوم أو داكن/أسود.
   4. محلول فيتامين قابل للذوبان في الماء (1000 مل): إذابة 100 ملغ من هيدروكلوريد الثيامين (ثيامين-HCl)، 100 ملغ من حمض D-بانتوثينيك، 100 ملغ من النياسين، 100 ملغ من البيريدوكسين، 5 ملغ من حمض P-أمينوبنزويك، و0.25 ملغ من فيتامين B12 في ماء منزوع الأيونات ليصل إلى حجم إجمالي يصل إلى 1000 مل.
   5. حمض الفوليك: محلول بيوتين (1000 مل): إذابة 10 ملغ من حمض الفوليك، 2 ملغ من دي-بيوتين، و100 ملغ من بيكربونات الأمونيوم (NH₄HCO₃) في ماء منزوع الأيونات ليصل إجمالي الحجم إلى 1000 مل.
   6. محلول الريبوفلافين (1000 مل: إذابة 10 ملغ من الريبوفلافين في محلول HEPES بحجم 5 ململ (4-(2-هيدروكسي إيثيل)بيبرازين-1-إيثانيسلفونيك أسيد) (1.19 جم/لتر) ليصل الحجم الإجمالي إلى 1,000 مل.
   7. محلول الحمين (10 مل): ذيب 5,000 ملغ من الهيمين في محلول هيدروكسيد الصوديوم (NaOH) بسعة 10 ملليمول (0.4 جم/لتر) لجعل الحجم الكلي يصل إلى 10 مل.
   8. خليط الأحماض الدهنية قصيرة السلسلة (10 مل): اجمع بين 2.5 مل من N-فاليريت، 2.5 مل من إيزوفاليرات، 2.5 مل من الإيزوبيوتيرات، و2.5 مل: DL-α-ميثيلبوتيرات.
      ملاحظه: ينصح باستخدام هذا المحلول باستخدام غطاء أبخرة لتجنب الرائحة والأبخرة.
   9. ريزازورين (1000 مل): إذابة 1 جرام من الريازورين في ماء منزوع الأيونات وجعل الحجم الكلي يصل إلى 1000 مل.
2. وسط يستخدم للتخمير اللاهوائي في المختبر
   1. لتحضير هذا الوسط، اخلط 330 مل من المحلول A، 330 مل من المحلول B، 10 مل من محلول المعادن الأثرية، 20 مل من محلول الفيتامينات القابل للذوبان في الماء، 5 مل من محلول الفولات: محلول البيوتين، 5 مل من محلول الريبوفلافين؛ 2.5 مل من محلول الهيمين، 0.4 مل من خليط الأحماض الدهنية قصيرة السلسلة، 1 مل من ريزازورين، 0.5 جرام من مستخلص الخميرة، 4 جرام من كربونات الصوديوم (Na₂CO₃)، 0.5 جرام من سيستين HCl-H₂O، و0.5 جرام من التريبتيكاز، بالإضافة إلى 296.1 مل من الماء المقطر.
   2. تحقق من الرقم الهيدروجيني وتأكد من أنه حوالي 7.0؛ إذا لم يكن كذلك، قم بضبط الرقم الهيدروجيني ب 1 N HCl أو 1 N NaOH. قم بالتعقيم عن طريق ترشيح الوسائط بالتفريغ باستخدام فلتر زجاجة تحت محطة العمل المعقمة.
   3. بدلا من ذلك، اخلط جميع المكونات (باستثناء محاليل الفيتامينات والهيمين) واستخدم المعقم على حرارة 121 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة واتركه يبرد إلى درجة حرارة الغرفة. في الوقت نفسه، قم بتعقيم محاليل الفيتامينات والمحاليل الخامسة باستخدام فلاتر غشائية بحجم 0.22 ميكرومتر وإضافتها إلى الوسائط المعمرة والمبردة قبل الصرف.

2. تحضير غرفة اللاهوائية والمواد المطلوبة

1. احتفظ بجميع المواد والمحاليل والأدوات اللازمة لتجربة التخمير داخل الغرفة اللاهوائية قبل 48 ساعة على الأقل من بدء التجربة، لضمان إزالة أي أكسجين متبقي مرتبط بالأدوات والأكسجين القابل للذوبان في المخازن/المحاليل وأن جميع المواد تتكيف مع الظروف اللاهوائية المحددة.
   ملاحظه: المواد المطلوبة داخل الحجرة اللاهوائية (قبل 48 ساعة من بدء التجربة): (1) وسط التخمير؛ (2) محلول لاهوائي (معد وفقا للقسم 4.1)، (3) فورتكسر، (4) ميزان الوزن، (5) أقمشة جبن الموسلين، (6) مقصات، (7) القمع، (8) أنابيب 1.5، 2.0، 15، 50 مل، (9) ماصة (2، 20، 200 و1000 ميكرولتر) وأطراف الماصات المتوافقة، (x) ماصة وماصات مسدس (5 و10 مل)، (11) مناديل ورقية، (22) أقلام، (33) أنابيب ترمز لأنابيب مختلفة، (14) صندوق نفايات، (xv) مؤشر O2 و(xvi) زجاجة بخاخ إيثانول بنسبة 70٪ (مطهر).

3. تحضير الأنابيب والألياف

1. يزن 300 ملغ من الإنولين وينقل إلى أنبوب بسعة 50 مل، يليه إضافة معقمة ل26 مل من وسط التخمير المحضر والمخزن مسبقا في الغرفة اللاهوائية. جهز أنبوبا فارغا لكل نوع من عينة البراز ولكل نوع من الأنابيب التجريبية (حسب عدد المركبات التي يتم اختبارها)، في ثلاث نسخ.
2. اترك هذه الأنابيب داخل الحجرة اللاهوائية لمدة حوالي 24 ساعة للسماح بترطيب العينات قبل بدء تجربة التخمير. تأكد من أن درجة حرارة الأنبوب 37 درجة مئوية عند التطعيم، لذا أحضر الأنابيب في الحاضنة داخل الغرفة اللاهوائية.

4. تحضير اللقاح

1. محلول التخفيف اللاهوائي (قبل تجربة التخمير ب 48 ساعة على الأقل): ذاب 5 جرام من NaCl، 2 جرام من الجلوكوز، و0.3 جرام من السيستين-HCl في ماء منزوع الأيونات وجعل الحجم الكلي يصل إلى 1000 مل. استخدم المعقم وتخزينه داخل الغرفة اللاهوائية قبل الاستخدام لمدة لا تقل عن 48 ساعة.
2. تحضير لقاح البراز (في يوم تجربة التخمير): وزن 5 جرام من عينة البراز الطازجة في أنبوب مخروطي بحجم 50 مل، أضف محلول تخفيف لاهوائي ليصل إلى حجم نهائي 50 مل (1:10 واط/فولت) ودوامة لمدة 15 دقيقة أو حتى يتجانس تماما. قم بتصفية الخليط المتجانس عبر أربع طبقات من قماش الجبن المعقم (المعقم بتعقيم الجسم) واستخدمه فورا للتطعيم في الأنابيب التي تحتوي على الوسط.
   ملاحظه: يمكن تجميع عينات البراز من مجموعة من المشاركين إذا كان الهدف التجريبي هو مقارنة تأثير مركب أو مكون معين على الميكروبيوتا البرازية الصحية والصحية بشكل عام.

5. التخمير وأخذ العينات

1. جهز الأنابيب وفقا للقسم 4.2 وتلقيح الأنابيب الفارغة/التحكم والتجارب ب 4 مل من لقاح البراز المخفف والمصفى. حضن الأنابيب الملقحة عند 37 درجة مئوية داخل الحجرة اللاهوائية. اهز الأنابيب مرة كل ساعة عن طريق عكس الأنبوب بلطف لإعادة تعليق الألياف واللقاح.
2. اجمع العينات بقدر ما يحتاج، على سبيل المثال، كل ساعة إلى 0، 3، 6، 9، و24 ساعة أثناء التخمير عن طريق إخراج عينة 2 مل من الليكوت إلى أنبوب 2 مل من أنابيب التخمير المعنية.
3. قياس درجة الحموضة للأليكوات باستخدام جهاز قياس الرقم الهيدروجيني المختبري (عن طريق إدخال قطب الرقم الهيدروجيني مباشرة في العينة)؛ قم بطرد الطرد المركزي للعينة المتبقية عند 14,000 x جرام لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. تجميد المادة الفائقة والحبيبات فورا في النيتروجين السائل، وبعد التجميد المفاجئ، تخزين المادة الفائقة لتحليل الأحماض الدهنية قصيرة السلسلة (SCFAs) والحبيبات لتحليل الميكروبيوم عند -80 درجة مئوية.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
بيكربونات الأمونيوم	سيغما-ألدرتش	217255
كبريتات الأمونيوم	TGI	C2388	سام
كلوريد الكالسيوم ثنائي هيدرات	سيغما-ألدرتش	C3306	مزعجه
سداسي هيدرات كلوريد الكوبالتوس	سيغما-ألدرتش	255599
ديهيدرات كلوريد الكوب	العضويات الأكروس	2063450000	سام، مزعج
سيستين-HCl	سيغما-ألدرتش	C121800
دي-بيوتين	سيغما-ألدرتش	B4501
حمض دي-بانتوثينيك	ألفا إيسار	A16609
ثنائي الصوديوم إيثيلين ديامين تترا أسيتات ديهيدرات	بيوراد	1610729
DL-α-ميثيلبوتيرات	سيغما-ألدرتش	W271918
كبريتات الحديد السباعي	سيغما-ألدرتش	F8263	سام
حمض الفوليك	ألفا إيسار	J62937
الجلوكوز	سيغما-ألدرتش	G8270
همين	سيغما-ألدرتش	H9039
هيبس	ألفا إيسار	A14777
إيزوبيوتيرات	ألفا إيسار	L04038
إيزوفاليرات	ألفا إيسار	A18642
سداسي هيدرات كلوريد المغنيسيوم	سيغما-ألدرتش	M8266
رباعي هيدرات كلوريد المنغنيز	سيغما-ألدرتش	221279
النياسين (حمض النيكوتينيك)	سيغما-ألدرتش	N4126
سداسي هيدرات كلوريد النيكل (II)	ألفا إيسار	A14366	سام
N-valerate	سيغما-ألدرتش	240370
حمض P-أمينوبنزويك	نائب الرئيس الصيني	102569	سام، مزعج
حمض الفوسفوريك	سيغما-ألدرتش	P5811
فوسفات البوتاسيوم ثنائي الهيدروجين	سيغما-ألدرتش	P5504
فوسفات هيدروجين البوتاسيوم	سيغما-ألدرتش	1551128
البيريدوكسين	ألفا إيسار	A12041
ريزازورين	سيغما-ألدرتش	R7017
الريبوفلافين	ألفا إيسار	A11764
صودا	سيغما-ألدرتش	1613757
كلوريد الصوديوم	كواشف فيشر الحيوية	7647-14-5
هيدروكسيد الصوديوم	فيشر كيميكاليات	S320
موليبدات الصوديوم ثنائي هيدرات	العضويات الأكروس	206375000
هيدروكلوريد الثيامين	العضويات الأكروس	148991000
تريبتيكاز	بكالوريوس العلوم الحيوية	211921
فيتامين ب12	سيغما-ألدرتش	V2876
مستخلص الخميرة	سيغما-ألدرتش	70161
كبريتات الزنك هيبتاهيدرات	سيغما-ألدرتش	Z0251
مرشح غشاء 0.22 ميكرومتر
خرزات التنقية المغناطيسية AMPure	أجنكور
حجرة لاهوائية مع حاضنة	نظام فورما اللاهوائي، ثيرمو ساينتيفيك، الولايات المتحدة الأمريكية
فلتر الزجاجة	كورنينج
القماش القطني
مقياس الرقم الهيدروجيني
دوار	العلم الحراري