التخمير الميكروهوائي لهيدرومحلات الخيزران بواسطة كليبسييلا الرئة

الملخص

المصدر: وي، د.، وآخرون، إنتاج المواد الكيميائية بواسطة كليبسييلا الرئة باستخدام هيدروليزات الخيزران كمادة خامة. J. Vis. Exp. (2017)

يوضح هذا الفيديو التحول الميكروبي للسكريات المشتقة من الخيزران إلى 2,3-بيوتانيديول عن طريق زراعة كلبسييلا الرئة في وسط قائم على التحلل تحت ظروف ميكروهوائية وحمضية خفيفة.

البروتوكول

1. إنتاج 2,3-بوتانيديول بواسطة النوع البري K. pneumoniae

1. استخدم 3 لتر من هيدروليزيت الخيزران كمذيب للتحضير المتوسط.
2. حضر وسط تخمير يحتوي على 4 جرام/لتر من الذرة المنقوع، 2 جرام/لتر (NH₄)₂SO₄، 6 جرام/لتر K₂HPO₄، 3 جم/لتر KH₂PO₄، و0.2 جم/لتر MgSO₄. اضبط درجة الحموضة في الوسيط إلى الحيادي باستخدام 2.5 ميلاتار NaOH. استخدم مفاعل حيوي سعة 5 لتر يحتوي على 3 لتر من وسط تخمير معقم للتخمير.
3. استخدم خلايا K. pneumoniae المخزنة في ثلاجة منخفضة درجة الحرارة -80°م.
4. لزراعة البذور، حضن قارورة بسعة 250 مل تحتوي على 50 مل من وسط لوريا-بيرتاني (LB) طوال الليل عند درجة حرارة 37 درجة مئوية، مع هز عند 200 دورة في الدقيقة. استخدم وسط LB يحتوي على 10 جرام/لتر تريبتون، و5 جرام/لتر مستخلص الخميرة، و10 جرام/لتر NaCl. ملاحظه: يجب أن تصل كثافة الخلايا في مزرعة البذور إلى OD 2 (كثافة بصرية عند 600 نانومتر).
5. قم بتطعيم قارورة واحدة بحجم 50 مل من مزرعة البذور في المفاعل الحيوي. حافظ على الزراعة عند درجة حموضة 6.0 و37 درجة مئوية. استخدم معدل تغذية هواء 2 لتر/دقيقة ومعدل تحريك 250 دورة في الدقيقة، مما يخلق حالة ميكروهوائية.
6. اجمع عينات بحجم 5 مل كل ساعتين أثناء التخمير وحللها باستخدام كروماتوغرافيا سائلة عالية الضغط لتحديد التركيزات الكيميائية في المرق.
7. راقب القلويات المضافة إلى المفاعل الحيوي عبر الإنترنت باستخدام نظام خلايا الوقود الميكروبية/جمع البيانات أو MFCS/DA.
   ملاحظه: تنتج الأحماض العضوية في عملية التخمير، ويضاف NaOH للحفاظ على استقرار درجة حموضة الثقافة. يمثل حجم القلويات المضاف كمية الحمض المنتجة. عندما تصل هضبة الخط المضاف بالقلويات، تنتهي العملية، إما بسبب استنفاد مصدر الكربون أو موت الخلايا.

2. إنتاج R-أسيتوين بواسطة طفرة budC من K. pneumoniae

1. جهز وسطا لإنتاج الأسيتوين يحتوي على 4 جرام/لتر من مشروب الذرة النقع، 2 جرام/لتر (NH₄)₂SO₄، 3 جرام/لتر أسيتات الصوديوم، 0.4 جرام/لتر KCl، و0.1 جرام/لتر ملغ SO₄.
2. استخدم K. pneumoniae-ΔbudC لإنتاج R-الأسيتوين. كرر الخطوات 1.4-1.5.
   ملاحظة: budC يشفر 2,3-بيوتانيديول ديهيدروجيناز. يفقد K. pneumoniae-ΔbudC نشاط إنزيم ديهيدروجيناز 2,3-بوتانيديول وينتج R-أسيتوين بدلا من 2,3-بيوتانيديول.
3. حافظ على الزراعة عند درجة حموضة 6.0 و37 درجة مئوية. استخدم معدل مكمل هواء 4 لتر/دقيقة ومعدل تحريك 450 دورة في الدقيقة، وهو حالة هوائية.
   ملاحظه: مكمل الأكسجين أعلى من إنتاج 2,3-بيوتانيديول.
4. قم بتحليل العينات كما في الخطوة 1.6.

3. 2- إنتاج حمض الكيتوغلوكونيك بواسطة البرعم: طفرة من K. pneumoniae

1. لإنتاج حمض الكيتوغلوكونيك 2، استخدم نفس الوسط المستخدم في إنتاج R-الأسيتوين.
2. استخدم K. pneumoniae-ΔbudA لإنتاج حمض الكيتوغلوكونيك 2-الاثنين. كرر الخطوات 1.4-1.5.
   ملاحظة: budA يشفر α-أسيتولاكتين ديكاربوكسيلاز. يفقد K. pneumoniae-ΔbudA نشاط ديكاربوكسيلاز α-أسيتولاكتات وينتج حمض الكيتوغلوكونيك 2-كيتوغلوكونيك، مستخدما الجلوكوز كركيزة.
   ملاحظة: تخليق حمض الكيتوغلوكونيك 2 هو عملية تعتمد على الحالة الحمضية. تم تطوير تخمير من مرحلتين لإنتاج حمض الكيتوغلوكونيك 2؛ في المرحلة الأولى، يتم تلقيح زراعة البذور في المفاعل الحيوي.
3. حافظ على الزراعة عند درجة حموضة 7.0 و37 درجة مئوية. استخدم معدل مكمل هواء 4 لتر/دقيقة ومعدل تحريك 500 دورة في الدقيقة.
   ملاحظه: في هذه الظروف، تنمو الخلايا بسرعة كبيرة (تصل كثافة الخلايا إلى الجرعة الزائدة 7 خلال حوالي 4 ساعات). ثم يتقدم التخمير إلى المرحلة الثانية، حيث ينخفض الرقم الهيدروجيني للزراعة إلى 5.0. لا يضاف أي حمض؛ الأحماض العضوية المنتجة في الزراعة تؤدي بشكل طبيعي إلى انخفاض درجة الحموضة. في هذه الظروف الحمضية، يتوقف نمو الخلايا، لكن حمض الكيتوغلوكونيك 2 يصنع ويتراكم في المرق.
4. قم بتحليل العينات كما في الخطوة 1.6. باستخدام تحليل الهيدروليزات من الخيزران كمصدر للكربون.
   ملاحظه: يتحول الجلوكوز في الوسط إلى حمض الكيتوغلوكونيك 2-الكيتوغلوكونيك، ويتحول الزيلوز إلى حمض الزيلونيك. وبالتالي، يتم الحصول على خليط من حمض الكيتوغلوكونيك 2 وحمض الزيلونيك.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
الأوتوكلاف	سانيو	3780
المفاعل الحيوي	سارتوريوس ستيديم بيوتيك	بوسطات أبلس
المحرض	إيكا	RW 20
نظام الكروماتوغرافيا السائل عالي الأداء	شركة شيمادزو	20AVP
مسحوق الخيزران	تم شراؤه من مقاطعة تشجيانغ، الصين		رقم الشبكة، 50
السليلاز	يوتيل بيوكيميكي، شاندونغ، الصين		200 PFU/mL