نهج قائم على الكروماتوغرافيا السائلة–مطيافية الكتلة لتحليل المستقلبات من S. aureus

الملخص

المصدر: سامويلز، د. ج. وآخرون. نهج قائم على الكروماتوغرافيا السائلة المزدوجة – مطياف الكتلة لتحليل المستقلبات للمكيرات العنقودية الذهبية. J. Vis. Exp. (2017)

يوضح هذا الفيديو استخدام الكروماتوغرافيا السائلة-مطيافية الكتلة لتحديد وقياس المستقلبات داخل الخلايا من S. aureus. يوضح الخطوات المتضمنة في استخراج المستقلبات، وتطبيع الببتيدات، والكروماتوغرافيا السائلة، والتحليل الطيفي الكتلي.

البروتوكول

1. استخراج المستقلبات

1. إذابة العينات على الجليد الرطب وتسبب تعطيل الخلايا في جهاز التجانس بأربع دفعات لمدة 30 ثانية عند 6000 دورة في الدقيقة، مع فترات تبريد مدتها دقيقتان على الجليد الجاف بين الدورات.
2. قم بتصفية الليزاتات لمدة 15 دقيقة في جهاز طرد مركزي دقيق مبرد مسبقا ومبرد عند أقصى سرعة (أي 18,213 × جرام عند ≤4 درجة مئوية).
3. انقل المادة الفائقة إلى أنبوب جهاز طرد مركزي دقيق نظيف.
4. باستخدام ميكروبايبت، نقل جزء صغير من العينة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق لقياس محتوى الببتيدات المتبقي في الخطوة 2؛ يخزن الباقي عند -80 درجة مئوية.
   ملاحظه: يختلف حجم العينة المحجوزة حسب اختبار حمض البيسينشونيك (BCA) المستخدم في الخطوة 2.1. يجب تخزين هذه العينة على جليد رطب للتحليل الفوري أو تجميدها عند -80 درجة مئوية.

2. اختبار حمض البيسينكونينيك (BCA)

1. قم بإجراء اختبار BCA كما أوصى به مصنع المجموعة، باستخدام عينات من الخطوة 1.4 لتحديد تركيز الببتيدات المتبقي لكل عينة.

3. الكروماتوغرافيا السائلة-مطيافية الكتلة (LC-MS)

1. اخلط 75 ميكرولتر من مستخلص المكورات العنقودية الذهبية (S. aureus) مع 75 ميكرولتر من مذيب LC-MS B، المحضر في الخطوة 1.4.
2. دوامة لتخلط وتدور عند 13,000 × جرام لمدة 5 دقائق.
3. ضع 100 ميكرولتر من المادة الفائقة في قارورة كروماتوغرافيا سائلة (LC) وغطيها بغطاء. تأكد من عدم وجود فقاعات هواء محبوسة في العينة.
4. قم بتحميل قوارير LC على جهاز السامبلر التلقائي LC-MS وتحرير القائمة الجارية في برنامج "محرر قوائم العمل غير المتصل".
   1. املأ أعمدة "اسم العينة" (مثلا، النوع البري 1)، و"موقع العينة" (مثل P1-A1)، و"الطريقة" (مثل طريقة حمض الفورميك السلب)، و"ملف البيانات" (مثل النوع البري 1). اضغط على زر "حفظ قائمة العمل". افتح برنامج "محطة عمل اكتساب بيانات الطيف الكتلي" وأدخل قائمة العمل المحفوظة سابقا. انقر على زر "بدء تشغيل قائمة العمل" لبدء القياس المستمر ل LC-MS.
5. افصل العينات على عمود، وربط العمود بمطياف زمن الطيران (TOF)، وربط مطياف TOF بنظام LC. استخدم تدرج طور متحرك كما يلي: 0-2 دقيقة، 85٪ مذيب B؛ 3-5 دقائق، 80٪ مذيب B؛ 6-7 دقائق، 75٪ مذيب B; 8-9 دقائق، 70٪ مذيب B; 10-11.1 دقيقة، 50٪ مذيب B; 11.1-14 دقيقة، 20٪ مذيب B; و14.1-24 دقيقة، 5٪ مذيب B؛ ينهي بفترة إعادة توازن مدتها 10 دقائق عند مذيب B بنسبة 85٪ ومعدل تدفق 0.4 مل على الأقل ¹.
6. باستخدام مضخة متساوية الوزن، قم بحقن محلول كتلة مرجعي في المسار للسماح بمعايرة محور الكتلة في نفس الوقت.
   ملاحظه: تعتمد هذه الخطوة على دليل مطياف TOF القياسي.
   1. استخدم خليط حمض الخليك D4 والفوسفازين السداسي (1H,1H,3H-رباعي فلوروبروبوكسي) كمحلول مرجعي للكتلة لإجراء المعايرة في الوقت الحقيقي. استخدم مضخة متساوية التوقيت بمعدل تدفق 2.5 مل في ^{الدقيقة 1} للتسريب (الحقن).

4. تصحيح دفعات لعدد الأيونات

1. تعيين أي عينة لتكون عينة مرجعية لتصحيح الدفعات (مثل النوع البري، التكرار 1).
2. احسب مجموع أعداد الأيونات لجميع المستقلبات داخل العينة المرجعية. كرر هذا الحساب لجميع العينات.
3. اقسم إجمالي عدد الأيونات في كل عينة على إجمالي عدد الأيونات في العينة المرجعية لتوليد نسبة.
4. اقسم عدد الأيونات لكل مستقلب داخل العينة على نسبة العينة إلى المرجع للحصول على عدد أيونات مصحح دفعة لكل مستقلب.

5. تطبيع الببتيدات

1. اقسم قيم عدد الأيونات المصححة دفعة لكل عينة تم الحصول عليها في الخطوة 4 على تركيز الببتيد الذي تم تحديده بواسطة اختبار BCA في الخطوة 2 للحصول على قيمة مطبعة لكل استيض.
   ملاحظه: يمكن مقارنة عدد الأيونات المصحح دفعة واحدة لكل مستقلب تم الحصول عليه في الخطوة 5.1 مباشرة بين السلالات وخضوعها لتحليل إحصائي (مثل اختبار مان-ويتني U). بدلا من ذلك، يمكن استخدام استقلاب معروف بأنه لم يتغير سواء بسبب العلاج أو الخلفية الجينية كعامل تطبيع لاكتشاف التغيرات الناتجة عن تحلل المستقلب. يمكن استخدام تضمين كمية معروفة من L-نورفالين أو حمض الجلوتاريك في مخزن الاستخراج لتصحيح الفقدان أثناء معالجة العينة.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
المواد/المعدات
أنابيب مقاومة للصدمات، 2 مل	يو إس إيه ساينتيفك	1420-9600
خرز السيليكا، 0.1 مم	شركة بايوسبك برودكتس إنك	11079101Z
متجانس بريسيلليس 24	بيرتين إنسترومنتس	EQ03119-200-RD000.0
مجموعة اختبار البروتين الدقيقة BCA	بيرس (العلوم الحرارية)	23235
عمود هيدريد الماس من النوع C	أجيلينت	70000-15P-2
سلسلة 6200 لزمن الطيران الدقيق (TOF) LC-MS	أجيلينت	G6230B
كوات بامب، سلسلة 1290	أجيلينت	G4204A
مضخة القمامة، سلسلة 1290	أجيلينت	G4220A
محرك الصمام، سلسلة 1290	أجيلينت	G1107A
مضخة إيزوكراتيك، سلسلة 1290	أجيلينت	G1310B
TCC، سلسلة 1290	أجيلينت	G1316C
سامبلر، سلسلة 1290	أجيلينت	G4226A
منظم الحرارة، سلسلة 1290	أجيلينت	G1330B
كيميائي
محلول ملحي مخزن بالفوسفات (درجة حموضة 7.4) 10 مرات	أمبيون	AM9624	قم بتخفيف الماء الطازج إلى 1x باستخدام ماء فائق النقي
الأسيتونيتريل	فيشر ساينتيفك	A955-500	أوبتيما LC-MS
حمض الفورميك	سيغما ألدريتش	94318	بالنسبة لمطياف الكتلة، 98٪
ماسهانتر	أجيلينت	G3337AA
السلالة البكتيرية	جنس	وتر	الجيني
SRB 337	المكورات العنقودية الذهبية	USA200 MSSA UAMS-1	النوع البري
SRB 372	المكورات العنقودية الذهبية	USA200 MSSA UAMS-1	ΔcodY::erm