مراقبة نمو البكتيريا في تركيبات وسائط مختلفة باستخدام مفاعل ميكروبيولوجي آلي

الملخص

المصدر: هيمريش، ج. وآخرون. بروتوكول تحسين إنتاج البروتينات غير المتجانسة باستخدام تقنية المفاعلات الحيوية الدقيقة الآلية. J. Vis. Exp. (2017).

يوضح هذا الفيديو استخدام مفاعل ميكروبيولوجي آلي لمراقبة نمو البكتيريا وإفراز البروتينات الفلورية استجابة لتركيبات وسائط مختلفة. يتم زراعة بكتيريا معدلة وراثيا تعبر عن بروتين فلوري إفرازي تحت الانتقاء المضادي الحيوي وتلقيح في آبار متنوعة من العناصر الغذائية. تمكن القياسات البصرية اللحظية لكثافة الخلايا والفلورة من التحليل المقارن لإنتاج البروتين عبر ظروف نمو مختلفة.

البروتوكول

1. إعداد المواد وإجراءات التعريف
ملاحظه: ينصح بتعريف وتثبيت الطرق التجريبية على مستوى مفصل. يضمن هذا التوحيد أن النتائج المختلفة يمكن تتبعها إلى التغيرات البيولوجية الجوهرية أو تركيبات وسط مختلفة. ​
ملاحظه: حلول الأسهم الإعلامية: جهز حلول الأسهم الفردية لجميع المكونات الإعلامية التي تم دراستها. جهز مخزونات مركزة للغاية للسماح بتخفيف أحجام مختلفة لجميع المكونات. هذا يعني أنه بعد دمج جميع المحاليل المخزنة بأعلى حجم لها وفقا لخطة التصميم، لا يمكن أن يتجاوز حجم الزراعة النهائي، انظر الفقرة "توليد قائمة توصيل المحلولات المتوسطة المخزون" الخطوة 1.3.3. إذا أدى إضافة محلول عالي التركيز إلى انخفاض حجم الإضافة جدا، مثل < 1/100 من حجم الزراعة النهائي، قم بتخفيف محلول المخزون وفقا لذلك. على سبيل المثال، في هذه الدراسة، تم تعريف حجم التوصيل بأقل من 10 ميكرولتر على أنه غير ممكن. عادة ما تتركز محاليل العناصر النزرة حتى 1000 ضعف بالنسبة للتركيز القياسي النهائي في الوسط. من المفيد تركيز مكونات الوسائط كمضاعفات (X-fold) بالنسبة للتركيزات في الوصفة المرجعية. وبذلك، يتم تجنب حجم التوصيل بالماصات غير الممكن من الأعداد العشرية الجزئية. وصفات مفصلة لجميع محاليل المخزون لوسط CgXII مذكورة في الوثيقة التكميلية.

1. بنك الخلايا العاملة (WCB)
ملاحظة: لكل تجربة نمو، يستخدم أليكوت واحد من WCB. إذا احتجت إلى المزيد من الأعطية، استخدم وسط 100 مل لتسريب القلب الدماغي (BHI) في قوارير الاهتزاز بحجم 1000 مل أو قم بتلقيح عدة قوارير هز، والتي تجمع قبل إضافة محلول الجلسرول.

1. تحضير مستعمرات منفردة لسلالة التعبير المؤتلف C. glutamicum pCGPhoDBs-GFP43 على صفائح الأجار (مسحوق BHI 37 جرام/لتر، 20 جم/لتر أجار، 25 ملغ/لتر كاناميسين). يمكن أن تأتي مادة الطلاء إما من تحول جديد أو من أليكوت محجوز بالتجميد. يحتضن عند 30 درجة مئوية حتى تظهر مستعمرات فردية؛ عادة ما يستغرق هذا من يوم إلى يومين.
2. قم بتلقيح قارورة الهزاز (وسط BHI بقوة 50 مل مع 25 ملغ/لتر كاناميسين، 500 مل قارورة محجوبة، 250 دورة في الدقيقة، قطر اهتزاز 25 مم، 30 درجة مئوية) بمادة المستعمرة وحضن الحوض طوال الليل (حوالي 16 ساعة).
3. اجمع حجما واحدا من تعليق الخلية الناتج مع حجم واحد من محلول الجلسرول المعقم 500 جرام/لتر ووزع على 2 مل أليكوت في قوارير حفظ التبريد المعقمة. تخزين عند -80 درجة مئوية.

2. بروتوكول زراعة MBR
ملاحظه: بالنسبة لنظام BioLector MBR المستخدم في هذه الدراسة، فإن الضوء المتشتت (الكتلة الحيوية) وتوهج GFP هما قياسات للشدة، وتتطلب تخصيص قيمة كسب معينة. كلما زاد الكسب، زادت تضخيم الإشارة البصرية؛ لهذا السبب أيضا يتم قياس الضوء المتشتت والفلورة بوحدات عشوائية (A.U.). تحديد قيم الكسب المناسبة للكشف عن الكتلة الحيوية وGFP في التجارب الأولية، إلى جانب تكرار الاهتزاز وحجم التعبئة المناسبة لتجنب قيود الأكسجين عند تركيزات الكتلة الحيوية الأعلى خلال مراحل العملية اللاحقة. ضمنت ظروف الزراعة المستخدمة ("صفائح الزهور"، أي أنابيب MTP على شكل أزهار ب 48 بئرا، وتردد اهتزاز 1,200 دورة في الدقيقة، حجم تعبئة 1,000 ميكرولتر، و10 جرام/لتر جلوكوز كمصدر رئيسي للكربون) زراعة غير محدودة للأكسجين. للحصول على أقصى معدلات نقل الأكسجين الناتجة عن تركيبات أخرى من أحجام التعبئة وترددات الاهتزاز في وحدات MTP ذات 48 بئر على شكل أزهار، تتوفر أوراق بيانات من المورد. أيضا، قد تحدث عيوب نمو في الثقافات الفردية بسبب انخفاض كميات الركائز الثانوية (مثل النيتروجين والعناصر النزرة). لذا، تحقق من تركيزات الكتلة الحيوية في نهاية الزراعة. في هذه الدراسة، لم تلاحظ أي تأثيرات نمو مماثلة.

1. حدد بروتوكول الزراعة لنظام MBR ("BioLector") كما يلي:
2. مجموعة المرشحات 1: الكتلة الحيوية، الكسب 14. مجموعة المرشحات 2: رقم الهيدروجين، الكسب هو الإعداد المسبق. مجموعة المرشح 3: pO2، الكسب هو الإعداد المسبق. 4: GFP، زيادة 80.
3. تردد الاهتزاز: 1,200 دورة في الدقيقة.
4. درجة الحرارة: 30 درجة مئوية.
5. مدة الدورة: 15 دقيقة.
6. وقت التجربة: يدوي (لن يتوقف الزراعة تلقائيا).

3. توليد قائمة توصيل المحلولات متوسطة المخزون
ملاحظه: تقريبا أي نظام روبوت لمعالجة السوائل قادر على قراءة إجراءات التوصيل من الملفات الخارجية. بشكل أساسي، الحد الأدنى من المعلومات المطلوبة هو حجم النقل وموقع مصدر الكاشف، بالإضافة إلى وجهة كل منها التي تمثل بموقع برنامج المختبر على السطح الروبوتي وتجويف محدد داخل الجهاز. ومع ذلك، يجب أخذ قواعد صياغة مختلفة لأنظمة معالجة السوائل المختلفة في الاعتبار. يوضح الشكل 1 نموذجا لهيكل الملفات لنظام التوصيل بالماصات المستخدم في هذه الدراسة.

1. يتم إدخال أربعة أنواع من محاليل المخزون في كل بئر زراعة:

1. حلول الأسهم لمكونات الوسائط المتنوعة ("أسهم التغير").
2. الماء لتعويض الأحجام التراكمية المختلفة للمخزونات المذكورة أعلاه.
3. محلول مخزون ("مخزن الباقي") يحتوي على جميع المكونات الثابتة. يمكن تكوين هذا المحلول من مخزونات تحتوي على المكونات المختلفة التي تخزن، مثلا، في درجات حرارة مختلفة أو تعقمها بطرق مختلفة.
4. اللقاح، الذي يجب إضافته كمكون أخير ووضعه على طاولة العمل قبل الإضافة لتجنب ترسيب الخلايا.

2. لكل بئر زراعة، احسب الأحجام التي سيتم نقلها لجميع مكونات الوسائط وفقا ل:

قد يكون الحجم المضاف لبعض أسهم التغيرات صفرا، أي عندما يتم حذف هذا المكون المحدد.

3. مراجعة جميع الأحجام المحسوبة Vi لأرقام مناسبة. يجب ألا تكون زيادات حجم التوصيل في حجم التوصيل صغيرة جدا. إذا لزم الأمر، قم بضبط تركيزات أسهم التغير. على سبيل المثال، تم تعريف الحد الأدنى لحجم الماصات هنا بأنه 10 ميكرولتر، والزيادة الدنيا بأنها 5 ميكرولتر. بشكل عام، يجب تعريف هذه الأحجام بناء على الدقة والدقة التي تم تحديدها تجريبيا لمحطة معالجة السوائل المستخدمة.

4. حساب حجم مخزون البقية الذي يحتوي على المكونات الثابتة لجميع الآبار كما يلي:

حيث يستخدم الحجم التراكمي الأقصى لمخزون التغير. وبالتالي، احسب التركيزات المطلوبة للمكونات الثابتة في المخزون الرابح كما يلي:

جهز مخزون الباقي وفقا لذلك.

5. لكل بئر زراعة، احسب حجم المياه المراد إضافته كما يلي:

6. لكل بئر زراعة، قم بإدراج جميع الأحجام التي ستضيف بترتيب الإضافة التالي: _{V H2O}، V_RestStock، V_i،_{V Inok}. قم بتنسيق قائمة التوصيل وفقا لمواصفات محطة معالجة السوائل، كما هو موضح على سبيل المثال في الشكل 1.

2. زراعة البذور، التحضير الآلي للإعلام، وبداية الثقافة الرئيسية

1. أنشئ بروتوكولا لروبوت معالجة السوائل. انظر الشكل 2 والشكل 3 لنموذج بروتوكول لنظام "Janus"، تم تنفيذه في برنامج "WinPREP" المقابل. يجب أن يأخذ البروتوكول في الاعتبار الجوانب التالية:

1. تضمين فترة تشغيل كافية للسكن المعقم قبل التحضير الإعلامي.

2. أضف تنظيفا وغسلا مفرطا أوليا لجميع أطراف الأنابيب والصناب.

3. اختر حاويات أدوات المختبر المناسبة لحلول المخزون. هنا، صفائح البئر العميقة ذات 12 عمودا مناسبة لتخزين مخزونات التغير، حيث يمكن لجميع رؤوس الماصبات الثمانية أن تغوص بترتيب مواز داخل أعمدة البئر. هذا يسرع بشكل كبير من التحضير الإعلامي. إذا تم استخدام أنابيب كاشف بسعة 15 أو 50 مل كمكامن فقط، يمكن لرأس أنبوب واحد فقط أن يغمس فيه في نفس الوقت. بالنسبة لمخزونات أخرى مثل الماء ومخزون الباقي، تستخدم أحواض بسعة 100 مل، حيث تتطلب هذه الحلول كميات أكبر إجمالا.

4. توفير حجم إجمالي كاف لكل محلول مخزون لتعويض كميات الهدر، وإزاحة الارتفاع في الأنابيب وما إلى ذلك.

5. أدخل تنبيه المستخدم قبل خطوة التطعيم، مع التأكد من تنفيذ هذه الخطوة مباشرة قبل إجراء زراعة البذور.

2. جهز جميع محاليل المخزون بطريقة معقمة وتخزينها حتى الاستخدام، في حاويات مناسبة، مثل أنابيب اختبار معقمة بسعة 15 مل و50 مل.
3. تعقيم ألواح البئر العميق لتخزين المحاليل على طاولة العمل، مثل المسح بنسبة 70٪ إيثانول ثم التجفيف لاحقا في غطاء تدفق طبقي.
4. ابدأ زراعة البذور بتلقيح وسط BHI بسعة 50 مل يحتوي على 25 ملغ/لتر كاناميسين مع أليكوت واحد من WCB. قبل زراعة MBR، حضر لقاحات طازجة وحيوية من مزارع بذور تنمو بشكل كبير بكمية كافية.
5. ضع جميع أدوات المختبر اللازمة على طاولة العمل الروبوتية واصب المحاليل المختبرية في المعالج المناسب.
6. ابدأ سير العمل الآلي لتحضير الوسائط، بحيث يتم الوصول إلى الخطوة الأخيرة (التطعيم) في الوقت المناسب مع بدء زراعة البذور. يجب تقييم إجمالي وقت تشغيل سير العمل الآلي مسبقا. هنا، كان إجمالي مدة العرض حوالي 1.5 ساعة.
7. خذ عينات من زراعة البذور بعد حوالي ساعتين، ثم كل ساعة، لمراقبة النمو بالكثافة الضوئية (OD₆₀₀). بعد حوالي 5 ساعات، تصل الزراعة إلى 3-4 دكتورات_{جرعة من الصفر 600} وتستخدم لتطعيم الثقافات الرئيسية.
8. ضع زراعة البذور على طاولة معالجة السوائل واستمر في بروتوكول تحضير الوسائط. زراعة الفقمات MTP بعد التطعيم.
9. ضع جهاز الزراعة المغلق في جهاز BioLector وابدأ بروتوكول الزراعة المحدد مسبقا.
10. تخلص من المحاليل المتبقية وفقا للوائح السلامة البيولوجية إذا لزم الأمر، وزرع الزراعة من طاولة العمل الروبوتية. نظف المختبر القابل لإعادة الاستخدام وابدأ بروتوكول إزالة التلوث في معالج السوائل.

النتائج

الشكل 1: لقطة شاشة من قائمة التوصيل بحجم لتحليل الحساسية. الإدخالات في العمود الأول تعطي معرفا فريدا لجميع أحجام الصف؛ هذا المعرف هو رقم البئر MTP للزراعة المستهدفة على طاولة معالجة السوائل، انظر الشكل 3C. الأعمدة ال...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
بيوليكتور	M2P-Labs	G-BL-100
لوحة الزهور	M2P-Labs	MTP-48-BOH	للزراعة في جهاز BioLector
ورق الختم	M2P-Labs	F-GP-10	الختم المعقم للوحة الزهور
ماتلاب	ماث ووركس	2016ب
كريكيت	Forschungszentrum Jülich	لا يوجد	متاح مجانا، يتطلب تركيب MATLAB
روبوت التوصيل بأنابيب جانوس	بيركين إلمر	لا يوجد	يتضمن تثبيت برنامج "WinPrep"
صفيحة صغيرة بعمق 12 عمودا	E&K ساينتيفك	EK-2034	حاوية للحلول متوسطة المخزون
C. glutamicum pCGPhoDBs-GFP	لا يوجد	لا يوجد	يحمل بلازميد pEKEx2 مع دمج جين GFP وببتيد إشارة PhoD من B.subtilis كإدخال تعبير. يوفر البلازميد مقاومة للكاناميسين. وصف ونشر بواسطة ميسنر وآخرين. Appl Microbiol Biotechnol 76 (3)، 633–642 (2007)