الحفظ طويل الأمد بالتبريد لسلالات البكتيريا الزرقاء باستخدام الجلسرول أو كبريتات ثنائي ميثيل

الملخص

المصدر: ليا-سميث، دي. جي.، وآخرون. توليد الطفرات الموسومة وبدون علامات في الأنواع الزرقاء النموذجية. J. Vis. Exp. (2016)

يوضح هذا الفيديو حفظ السلالات الزرقاء بالتجميد من خلال دمج معلقات الخلايا المركزة مع الجلسرول أو DMSO وتخزينها في درجات حرارة منخفضة، مما يمكن من الحفاظ طويل الأمد على الزراعة الصالحة للتمثيل الضوئي والدراسات الجينية.

البروتوكول

1. إعداد الإعلام الثقافي

1. تحضير BG11 المتوسط
   1. تحضير محاليل مخزون 100x BG11، والعناصر النزرة، ومخزون الحديد (الجدول 1).
   2. حضر محاليل منفصلة من مخزون الفوسفات، ومخزون كربونات الصوديوم (Na₂CO₃)، ومخزون N-[تريس(هيدروكسي ميثيل)ميثيل] -2-أمينوإيثانيسلفونيك حمض (TES)، وبيكربونات الصوديوم (NaHCO₃) (الجدول 1).
   3. استخدم معقمين الفوسفات ومخزون Na₂CO₃ . تعقيم مخزن TES وNaHCO₃ بمرشحات بحجم 0.2 ميكرومتر.
   4. جهز BG11 بدمج 976 مل من الماء، و10 مل من 100x BG11، و1 مل من العناصر النزرة، و1 مل من مخزون الحديد، ثم تعقيم المحلول. بعد أن يبرد هذا المحلول إلى درجة حرارة الغرفة، أضف 1 مل من مرق الفوسفات، و1 مل من مرق Na_2CO3، و10 مل من NaHCO₃.
   5. بالنسبة للوسط الصلب BG11، أضف 15 جرام من الأجار و700 مل من الماء إلى قارورة واحدة. أضف إلى القارورة الثانية 3 جرام من ثيوسلفات الصوديوم (Na₂S₂O₃)، 226 مل من الماء، 10 مل من 100x BG11، 1 مل من العناصر النزرة، و1 مل من مرق الحديد. استخدم الأوتوكلاف. بعد أن تبرد هذه المحاليل إلى درجة حرارة الغرفة، امزجها وأضف 1 مل من مرق الفوسفات، و1 مل من مرق Na₂CO₃ ، و10 مل من مخزن TES، و10 مل من NaHCO₃.
      ملاحظه: يتم تحضير المحاليل بشكل منفصل لتجنب ترسيب بعض الأملاح.
2. للاختيار على السكروز، حضر محلول سكروز بنسبة 50٪ (بدون زجاجة). قم بتعقيم المحلول بمرشحات 0.2 ميكرومتر وأضف إلى BG11 (100 مل من السكروز 50٪ إلى 900 مل من BG11) لإنتاج صفائح السكروز BG11/5٪.
   ملاحظه: لا تضيف NaHCO₃ إلى صفائح السكروز BG11/5٪. أضف Na₂وCO₃ كالمعتاد.
3. لزراعة سينشوكوكوس، أضف 10 مل من 1 M 4-(2-هيدروكسي إيثيل)بيبرازين-1-إيثانيسلفونيك أحماض ونيتروجين (2-هيدروكسي إيثيل) بيبرازين-N′-(2-إيثانيسلفونيك حمض HEPES) و1 مل من فيتامين B12 (الجدول 1) إلى 1 لتر من وسط BG11.
   ملاحظه: تحويل السلالات المستزرعة في وسائط BG11 التجارية المتاحة أقل كفاءة بشكل ملحوظ مقارنة بوصفات وسائط BG11 الموضحة هنا، ولذلك لا ينصح به.

2. التخزين طويل الأمد للسلالات

1. قم بإعداد زراعة جديدة للسلالة عن طريق تلقيح حلقة مليئة بالخلايا في 30-50 مل من وسط BG11. ازرع الزراعة لمدة 3-4 أيام حتى تصل إلى جرعة جرعة_{زائدة 750 نانومتر} = 0.4 إلى 0.7.
2. اغسل الخلايا مرة واحدة مع BG11 وأعد تعليقها في ~2 مل من BG11.
3. أضف 0.8 مل من الخلايا المركزة إلى أنبوب واحد. ثم أضف 0.2 مل من الجلسرول المعقم بالفلتر بنسبة 80٪.
4. اختياري: أضف 0.93 مل من الخلايا المركزة إلى أنبوب آخر. أضف 0.07 مل من DMSO إلى هذا الأنبوب.
   أنذر: DMSO سام ويجب التعامل معه بحماية مناسبة.
5. خزن كلا الأنبوبين عند -80 درجة مئوية. لإحياء السلالات، قم بإزالة الأنبوب وكشط بعض الخلايا باستخدام عود أسنان حاد على صفيحة أجار بدون مضادات حيوية. اخرج بشكل طبيعي باستخدام حلقة معقمة.

الجدول 1: الحلول المستخدمة في هذه الدراسة

وصفات محلول المرق
كيميائي	الكمية (g)
100x BG11 (لكل لتر)
NaNO3	149.6
MgSO4.7H 2O	7.49
CaCl2.2H 2O	3.6
حمض الستريك	0.6
أضف 1.12 مل 0.25 ميلاتار Na2EDTA، درجة حموضة 8.0
0.25 M Na2EDTA، الرقم الهيدروجيني 8.0 (لكل 100 مل)
نا2إيدتا	9.3
العناصر النزرة (لكل 100 مل)
H3BO3	0.286
MnCl2.4H 2O	0.181
ZnSO4.7H 2O	0.022
نا2موأو 4.2 أوه 2 أو	0.039
CuSO4.5H 2O	0.008
Co(NO3)2.6H 2O	0.005
مخزون الحديد (لكل 100 مل)
سترات الأمونيوم الحديدي	1.11
مخزون الفوسفات (لكل 100 مل)
K2HPO4	3.05
كمية Na2CO3 (لكل 100 مل)
نا2CO3	2
مخزن TES، pH 8.2 (لكل 100 مل)
TES	22.9
مخزون NaHCO3 (لكل 100 مل)
NaHCO3	8.4
HEPES، درجة حموضة 8.2 (لكل 500 مل)
هيبس	119.15
فيتامين B12 (لكل 50 مل)
السيانوكوبالامين	0.02
لوريا بيرتاني ميديا (Per 500 مل)
مرق لوريا بيرتاني	12.5
1 مليون MgCl2 (لكل 100 مل)
MgCl2.6H 2O	20.33
الحل A (لكل 200 مل)
MnCl2.4H 2O	0.395
CaCl2.2H 2O	1.47
حمض 2-(N-مورفولينو)إيثانيسلفونيك هيدرات، 4-حمض مورفولين إيثانيسلفونيك (MES)	0.4265
محلول A + جلسيرول
محلول 10 مل A
1.5 مل من الجلسرول

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
NaNO₃	سيغما	S5506
MgSO₄·7H₂O	سيغما	230391
CaCl₂	سيغما	C1016
حمض الستريك	سيغما	C0759
Na₂EDTA	صياد	EDT002
H₃BO₃	سيغما	339067
MnCl₷4H₂O	سيغما	M3634
ZnSO₄·7H₂O	سيغما	Z4750
Na₂MoO₄·2H₂O	سيغما	331058
CuSO₄·5H₂O	سيغما	209198
Co(NO₃)₂·6H₂O	سيغما	239267
سترات الأمونيوم الحديدي	سيغما	F5879
K₂HPO	سيغما	P3786
Na₂CO₃	صياد	SODC001
TES	سيغما	T1375
NaHCO₃	صياد	SODH001
هيبس	سيغما	H3375
السيانوكوبالامين	سيغما	47869
Na₂S₂O₃	سيغما	72049
باكتو آجار	دينار بحريني	214010
سكروز	صياد	SUC001
طبق بيتري 90 مم ثلاثي التهوية	غرينر	633185
مرشحات 0.2 ميكرومتر	سارتوريوس	16534
قوارير مخروطية بحجم 100 مل	بايركس	CON004
بارافيلم M 100 مم × 38 م	بيميس	FIL003
بوليميراز DNA عالي الدقة Phusion	الفوزون	F-530
أغاروز	ميلفورد	MB1200
مجموعة تنقية الحمض النووي	موبيو	12100-300
إندونولياز تقييد	NEB
ليغاز T4	ثيرمو ساينتفيك	EL0011
مرق لوريا بيرتاني	إنفيتروجين	12795-027
مس	سيغما	M8250
كبريتات الكاناميسين	سيغما	60615
الأمبيسيلين	سيغما	A9518
مجموعة GeneJET لتحضير البلازميد	ثيرمو ساينتفيك	K0503
أنبوب دائري قاع بسعة 14 مل	BD فالكون	352059
بوليميراز الحمض النووي GoTaq G2 Flexi DNA	بروميغا	M7805
خرز زجاجي بحجم 425-600 ميكرومتر	سيغما	G8772
الجلسرين	سيغما	G5516
DMSO	سيغما	D8418
المصابيح الفلورية	جرو-لوكس	69
مفاعل ضوئي HT موليترون	إنفورز