نمذجة البلعمة المملة باستخدام خلايا الدم الحمراء المظلمة في المختبر

الملخص

المصدر: ناغري، ن. وآخرون. بلعمة الخلايا البلعمية الحويخية وإزالة البكتيريا في الفئران. J. Vis. Exp. (2019).

يوضح هذا الفيديو تقييم البلعمة التي توسطها مستقبلات المكملات باستخدام خلايا دم حمراء للأغنام مجهزة ب IgM والمكملة، تليها امتصاصها بواسطة بلاعم الفئران. يتم قياس مدى البلعمة من خلال قياس ناتج كروموجيني أزرق يتكون من أكسدة ديامينوفلورين المحفز بالهيموغلوبين.

البروتوكول

1. البلعمة التي تعبر عن FCΓR وCR

1. لعملية الحقن الجراحي، حضن 2 ×^{10 8} خلايا دم حمراء للأغنام (SRBCs) مع 50 ميكرولتر من مضاد SRBC-IgM للأرنب أو 50 ميكرولتر من مضاد SRBC-IgG للأرنب لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
2. حضن خلايا الدم البيضاء المجهولة IgM مع 50 ميكرولتر من مصل الإنسان الناقص C5 (C5D) لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية لتثبيت شظايا المكمل C3b وC3bi على SRBCs المطلية ب IgM.
3. الخلايا البلعمية البذرية (MH-S) (10,000 خلية/بئر) في صفيحة تحتوي على 96 بئرا وتحتضن طوال الليل للحصول على التقاء ~70٪. أضف 100 ميكرولتر من 1 × 10 أقراص SRBC أوبسونية بحجم⁷/مل إلى كل بئر من خلايا MH-S وحضن لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية. غسل SRBCs غير المرتبطة بسرعة كبيرة (~1 دقيقة) ب 100 ميكرولتر من محلول تحلل كلوريد الأمونيوم-البوتاسيوم (ACK).
4. قم بتحليل الخلايا التي تحتوي على 0.1٪ SDS وإضافة 50 ميكرولتر من 2,7-ديامينوفلورين (DAF) يحتوي على 3٪ بيروكسيد الهيدروجين و6 مولار يوريا. قس امتصاص تكوين الفلورين الأزرق المحفز بالهيموغلوبين عند 620 نانومتر.
5. تحديد عدد SRBCs باستخدام منحنى قياسي عند قيم امتصاص 620 نانومتر مع عدد معروف من SRBCs. وبالمثل، يتم معالجة خلايا MH-S التي تم حضانها بخلايا SRBC غير أوبسونية لاستخدامها كضوابط سالبة.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
2,7-ديامينوفلورين (DAF)	سيغما-ألدرتش	D17106	درجة علم الأحياء الجزيئي
70٪ إيثانول	شركة ديكون لابز	18C27B	الدرجة التحليلية
صفيحة ذات 96 بئر	كورنينغ	3603	درجة علم الأحياء الخلوي
مخزن تحليل ACK	تقنيات الحياة	A10492	درجة علم الأحياء الجزيئي
مصل ناقص في C5	سيغما-ألدرتش	C1163	كاشف كيميائي حيوي
الطرد المركزي	لابنت إنترناشونال	C0160-R
جهاز الطرد المركزي الخلوي السيتوسبين 4	ثيرموفيشر ساينتيفيك	A78300101 العدد 11
وسائط DMEM لثقافة الخلايا	جيبكو	11995-065	درجة علم الأحياء الخلوي
FBS	أتلانتا بيولوجيالز	S11550	درجة علم الأحياء الخلوي
مقياس التدفق الخلوي	بكالوريوس العلوم الحيوية	FACSCalibur
فلو جو سوفتوير	فلوجو، ذ.م.م
الملقط	دومون	0508-SS/45-PS-1	مناسب لتشريح المختبرية
طبق زجاجي قاع	شركة ماتيك	P35G-0.170-14-C	درجة علم الأحياء الخلوي
الحقنة عالية الضغط	بن سينشري	FMJ-250	مناسب للاستخدام في المخبرية
الهومونينازر	أومني إنترناشونال	TH-01
بيروكسيد الهيدروجين	سيغما-ألدرتش	H1009	الدرجة التحليلية
المجهر الفلوري المقلوب	أوليمبوس	IX73
جهاز الرش الدقيق	بن سينشري	IA-1C	مناسب للاستخدام في المخبرية
بارافورمالديهايد	سيغما-ألدرتش	P6148	درجة الكواشف
PBS	جيبكو	20012-027	درجة علم الأحياء الخلوي
الأرنب المضاد ل SRBC-IgG	MP Biomedicals	55806	مناسب للاختبارات المناعية
الأرنب المناهض ل SRBC-IgM	مختبرات سيدارلين	CL9000-M	مناسب للاختبارات المناعية
المقص	ميلتكس	5-2	مناسب لتشريح المختبرية
خلايا الدم الحمراء للأغنام (SRBCs)	MP Biomedicals	55876	الناقلات المغسولة والمحفوظة