يوضح هذا الفيديو بروتوكولا لعزل البكتيريا المعوية محل الاهتمام من ديدان التهاب القيران البري. يتم أولا تجويع الديدان وغسلها للقضاء على البكتيريا المتبقية من سطحها وأمعاءها مع الحفاظ على الميكروبات المستهدفة. بعد تنظيف السطح وخطوات الزحف المتعددة، يتم تشريح الديدان لاستخراج الأمعاء التي تحتوي على البكتيريا المعنية، والتي تجمع ثم تجمد للتخزين.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
التنظيف الانتقائي لديدان التهاب القيعان الهندي لتثبيط ميكروبيوم الأمعاء
330 مشاهدة
⸱
فبراير 2, 2026
في هذه المقالة
الملخص
البروتوكول
1. تشريح الأمعاء وتحديد الأنواع الميكروبية باستخدام PCR
1. زراعة على حرارة 20 درجة مئوية لمدة 3-4 أيام للسماح لها بالجوع وتقليل كمية بكتيريا OP50-1 (سلالة الإشريكية القولونية OP50-1). أضف 5 مل من وسط M9 إلى صفيحة الديدان الجائعة.
2. باستخدام ماصة ومصباح زجاجي معقم، قم بإزالة الماصة على ديدان M9+ من اللوح ونقلها إلى أنبوب طرد مركزي معقم بسعة 15 مل.
3. باستخدام جهاز طرد مركزي سريري، قم بتدوير الديدان في الأنبوب بقوة 1000 x g لمدة 30 ثانية في درجة حرارة الغرفة.
4. باستخدام ماصة معقمة بسعة 15 مل، أزل المادة الفائقة من أنبوب الطرد المركزي دون إزعاج الديدان الحية في قاع الأنبوب.
5. أضف 10 مل من M9 + 0.05٪ ترايتون X-100 وحضن الأنبوب على جهاز نوتاتور لمدة 20 دقيقة لإزالة الميكروبات الخارجية. كرر ذلك أربع مرات لغسل الديدان.
6. بعد الغسيل الأخير، باستخدام طرف ماصة معقمة، أزل المادة الفائقة دون إزعاج الحبيبة في القاع في محلول 100 ميكرولتر.
7. باستخدام رأس ماصة معقمة، انقل M9 والديدان إلى صفيحة NGM غير مزروعة واترك اللوح يجف بينما تزحف الديدان لمدة 20 دقيقة للمساعدة في إزالة OP50-1 من الجلد والأمعاء.
8. أضف 250 ميكرولتر من M9 إلى اللوحة المجافة واستخدم ماصة زجاجية لنقل ديدان M9+ إلى صفيحة NGM جديدة غير مزروعة. مرة أخرى، دع الطبق يجف ودع الديدان تزحف لمدة 20 دقيقة.
9. أضف 250 ميكرولتر من M9 إلى اللوحة وانقل 100 ميكرولتر من ديدان M9+ إلى زجاج ساعة نظيف.
10. باستخدام إبرتين معقمات بسعة 26 جرام، اقطع رأس الديدان الخيطية بتثبيت الدودة بإبرة واحدة واستخدام الإبرة الأخرى لقطع الدودة. بعد قطع الرأس، تخرج الأمعاء (الحبيبية) وغدد التناسل (الشفافة) من الجسم بشكل طبيعي من الجسم.
11. اقطع قطعة من الأمعاء المكشوفة عن طريق تثبيت الأمعاء بإبرة واحدة وقطعها بالأخرى.
ملاحظة: إذا أمكن، تحقق من أن الميكروب المعني لا يزال موجودا في الأمعاء المنبثقة باستخدام مجهر نورمارسكي، أو التهجين الفلوري في الموقع (FISH)، أو الكيمياء المناعية النسيجية.
12. نقل أمعاء واحدة مقطعة إلى أنبوب PCR بسعة 0.5 مل يحتوي على 10 ميكرولتر من الماء المعقم. كرر العملية ليصل المجموع إلى ما لا يقل عن 5 أنابيب تفاعل البوليميراز (PCR) تحتوي على أمعاء من مختلفة.
13. تجميد أنابيب PCR على -80 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 5 دقائق. أزل أنابيب PCR من الفريزر وذيب العينات.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| أغاروز | فيشر ساينتيفك | BP1356 | |
| 10٪ SDS | إنفيتروجين | AM9822 | |
| إبرة BD PrecisionGlide - 26 G | فيشر ساينتيفك | 305115 | |
| KH₂PO₄ | فيشر ساينتيفك | P-286 | |
| NaCl | فيشر ساينتيفك | S-671 | |
| NH₄Cl | فيشر ساينتيفك | A-661 | |
| الستربتوميسين | ميليبور-سيغما | S6501-50G | |
| تتراسيكلين | ميليبور-سيغما | T7660-5G | |
| ترايتون X-100 | فيشر ساينتيفك | BP-151 | |
| نظارات الساعة | VWR | 470144-850 |
الوسوم
