التهجين الفلوري في الموقع لبكتيريا الأمعاء في مقاطع أمعاء الفئران

الملخص

المصدر: نغ، ك. م.، تروبيني، سي. تصور تفاعلات ميكروبيوم الأمعاء مع المضيف عبر التهجين الفلوري في الموقع ، تلوين الليكتين، والتصوير. J. Vis. Exp. (2021).

يوضح هذا الفيديو عملية التهجين بالفلورة في الموقع (FISH) لتلوين ميكروبيوتا الأمعاء داخل أنسجة أمعاء الفئران عن طريق تهجين المجسات الفلورية مع حمض الريبونوكلييك البكتيري (rRNA) وصبغ هياكل المضيف للتحليل المجهري.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات المتعلقة بعينات والموافقة عليها من قبل لجنة مراجعة أخلاقيات المختصة

1. التلوين البكتيري باستخدام FISH (التهجين بالفلورة في الموقع)
   1. استخدم حاصر سائل أو قلم PAP (قلم حاجز كاره للماء) للحد من مساحة تمدد السائل عن طريق تدوير منطقة كل جزء من الأنسجة. تأكد من أن الحبر لا يلامس القسم نفسه. أنشئ دائرة قريبة قدر الإمكان من كل جزء من النسيج دون ملامسة النسيج لتقليل مساحة السطح التي تحتاج إلى تغطيتها بمحلول التهجين.
   2. جهز محلول التهجين: لكل 50 ميكرولتر من محلول التهجين المسخن مسبقا، أضف مسبار 0.5 ميكروغرام (مثلا، 0.5 ميكرولتر من 1 ميكروغرام/ميكرولتر). قم بعمل محلول التهجين على الأقسام الموجودة في الشريحة (~20 ميكرولتر/مقطع، حسب حجم المقطع/الدائرة). حماية محلول التهجين والشرائح من الضوء من هذه النقطة فصاعدا أثناء خطوات الحضانة والتخزين.
   3. تأكد من أن حجم السائل المستخدم يغطي القسم بالكامل عند تغطيته بغطاء بلاستيكي مرن. حضن السلايد في غرفة رطبة لتقليل التبخر. أنشئ غرفة رطبة تحتوي على صندوق ماصات مع مناديل أو مناديل ورقية في الأسفل تم نقعها بمحلول هجين زائد أو محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) لتوفير الرطوبة. حضن الأقسام عند 45-50 درجة مئوية، حسب مجموعة المجسات، لمدة >3 ساعات.
   4. تسخين مخزن الغسيل FISH: 20 مللي مول Tris-HCl، درجة حموضة 7.4؛ من 0.9 متر NaCl إلى 50 درجة مئوية خلال فترة الحضانة. جهز كمية كافية من حاجز الغسيل لتغطية الشرائح في جرة كوبلن.
   5. أزيل أغطية البلاستيك؛ حضن الشرائح في مخزن غسيل FISH داخل جرة كوبلين، كلاهما مسخن مسبقا إلى 50°C. ضع جرة Coplin مرة أخرى في فرن 50°C لمدة 10-20 دقيقة. للحصول على عينات سميكة، أزل الغطاء من علبة كوبلين بإضافة الطبقة الحازمة وإزالة الغطاء بلطف لتجنب تلطيخ الشريحة.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
جرة كوبلين	فيشر	08-813E
زجاج الغطاء، 22 × 22 مم، لا #1	VWR	CA48366-227-1
DAPI	سيغما-ألدرتش	D9542	تم تعليق القرص إلى 5 ملغ/مل
صندوق نصيحة الماصة الفارغ			لإذابة البرافين
مجسات FISH
حل التهجين FISH	--	--	درجة حموضة ثلاثية إلى HCl 20 مللي ميل 7.4، 0.9 مل مل، حمض الكربون الطبيعي، 0.01٪ (بدون النفط) SDS في المياه الخالية من النوكليز. إضافة اختيارية من 5–50٪ فوراميد (v/v)
مخزن غسل الأسماك	--	--	20 مللي مولار تريس–HCl pH 7.4، 0.9 M NaCl
ليكتين Ulex Europaeus Agglutinin (UEA-1) الموسوم بالفلورية	مختبرات فيكتور	FL-1061 (موسوم بالفلورسين) أو RL-1062-2 (موسوم بالرودامين)	يضع UEA-1 علامات على الجليكانات المفرطة، لذا فهو غير مناسب للفئران الخالية من الجراثيم أو لعينات من مضيفين يعانون من نقص في فوكوسيلترانسفيراز 2 (FUT2).
الملقط
غطاء بلاستيكي مرن من HybriSlip، 22 × 22 مم × 0.25 مم	سيغما ألدريتش	GBL722222	لخطوات تهجين FISH، يمكن استبدال أغطية الزجاج
قلم ImmEdge للحاجز الكاره للماء PAP	مختبرات فيكتور	H-4000
كيموايبس
حاويات تخزين العينات متعددة الأغراض، 473 مل	فيشر	14-955-117A	يمكنك استبداله بوعاء زجاجي أو بولي إيثيلين من اختيارك. الميثاكارن غير متوافق مع البوليسترين أو المعادن.
طلاء الأظافر	علوم المجهر الإلكتروني	72180	أي طلاء أظافر يجب أن يكون مناسبا
الفرن			النطاق المطلوب: 45-60 درجة مئوية
PBS، محلول ملحي مخزن بالفوسفات (محلول 10x)	فيشر	BP3991	قم بتخفيف العدد إلى 1x للبروتوكول
كلوريد الصوديوم	فيشر	S271
محلول هيدروكلوريد تريزما، 1M Tris-HCl، درجة حموضة 7.4	سيغما-ألدرتش	T2663-1L
الماء، خالي من النوكلياز	فيشر	BP2484100