العزل القائم على الطرد المركزي فوق الفائق لحويصلات الغشاء الخارجية لفصيلة الليجيونيلا الرئوية

الملخص

المصدر: يونغ، أ. ل. وآخرون. الحويصلات الغشية الخارجية لمرض Legionella pneumophila: عزل وتحليل إمكاناتها الالتهابية على البلعميات. J. Vis. Exp. (2017)

يوضح هذا الفيديو عزل الحويصلات الغشائية الخارجية (OMVs) من Legionella pneumophila باستخدام الطرد المركزي التسلسلي، والترشيح المعقم، والطرد المركزي فوق الفائق. تعد الميكروفونات النقية النقية، الغنية ببروتينات الغشاء والدهون البوليسكاريدية، مناسبة لدراسات تفاعل المضيف والممرض.

البروتوكول

1. زراعة Legionella pneumophila

1. انشر سلالة L. pneumophila Corby (النوع البري، WT) على صفائح الأجار المستخلص من الفحم المخزن (BCYE) وحضنها عند 37 درجة مئوية لمدة 3 أيام. تلقيح 10 مل من مرق مستخلص الخميرة (YEB) عند OD₆₀₀ من 0.3 باستخدام L. pneumophila من لوحة ما قبل الزرعة؛ حضن البكتيريا عند 37 درجة مئوية على هزاز دوار (150 دورة في الدقيقة) لمدة 6 ساعات.
2. تحقق من نقاء الزراعة السائلة عن طريق نشر 100 ميكرولتر من التعليق على صفيحة أجار دمية. حضن الحوض طوال الليل عند درجة حرارة 37 درجة مئوية.
3. أضف ما تبقى من الزراعة السائلة إلى 90 مل من وسط YEB الطازج وحضن على هزاز دوار (37 درجة مئوية و150 دورة في الدقيقة) للوصول إلى OD₆₀₀ بين 3.0-3.5، والذي يستغرق حوالي 16-20 ساعة.

2. تحضير وقياس الحويصلات الغشائية الخارجية للريثانية الرئوية (OMVs)

ملاحظة: نفذ جميع خطوات الطرد المركزي التالية في ظروف معقمة وعند 4 درجات مئوية.

1. قم بعمل طرد مركزي في الزراعة السائلة بقوة 4000 x جرام لمدة 20 دقيقة لإزالة البكتيريا. انقل المادة الفائقة إلى أنابيب الطرد المركزي الطازجة، تخلص من الحبيبات البكتيرية، وكرر عملية الطرد المركزي (4000 × جرام لمدة 20 دقيقة). كرر هذه الخطوة مرة واحدة.
2. قم بترشيح الفائق المتبقي مرتين (حجم المسام: 0.22 ميكرومتر). انقل المادة الفائقة الخالية من البكتيريا إلى أنابيب الطرد المركزي فوق العالي والطرد المركزي فوق الدقيقة عند 100,000 × جرام لمدة 3 ساعات.
3. أخرج السوبرناتينت وتخلص منه. أعد تعليق حبيبة OMV في محلول ملحي معقم مخزن بالفوسفات (PBS) وجهاز طرد مركزي فوق الفوسفات (100,000 x جرام لمدة 3 ساعات) لإزالة البروتينات والLPS الملوثة.
4. تخلص من المادة الفائقة وأعد تعليق حبيبة OMV في 500 ميكرولتر من PBS المعقم. شريط 20 ميكرولتر على صفيحة أجار دموية وعلى صفيحة أجار BCYE لمنع التلوث البكتيري في الحويصلات المحضرة. حضن صفيحة الأجار الدموي طوال الليل وصحيحة الأجار BCYE لمدة 3 أيام (كلاهما عند 37 درجة مئوية).
   ملاحظة: تركيز 100 مل من زراعة L. pneumophila عادة ما يكون 1 ميكروغرام/ميكرولتر. تخزين الميكروفون المحضر والمحدد كميا عند -20 درجة مئوية.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
طبق بتري بقطر 10 سم	سارستيدت إيه جي & كو كي جي (نومبرخت، ألمانيا)	82.1473
دوار 70 Ti	شركة بيكمان كولتر (كاليفورنيا، الولايات المتحدة الأمريكية)	337922
الكوفيت	سارستيدت إيه جي & كو كي جي (نومبرخت، ألمانيا)	67.742
حاضنة هيراسيل 240i CO₂	شركة ثيرمو فيشر العلمية ألمانيا BV & Co KG (براونشفايغ، ألمانيا)	40830469
هيرايوس مولتيفيوج X3R	شركة ثيرمو فيشر العلمية ألمانيا BV & Co KG (براونشفايغ، ألمانيا)	75004515
حلقة التطعيم	سارستيدت إيه جي & كو كي جي (نومبرخت، ألمانيا)	86.1567.010
L. pneumophila كوربي	---	---
PBS	شركة بيوكروم GmbH (برلين، ألمانيا)	L 1825
الهزاز الدوار (MaxQ 6000)	شركة ثيرمو فيشر العلمية ألمانيا BV & Co KG (براونشفايغ، ألمانيا)	SHKE6000
ألتروسبيك 10	شركة بيوكروم المحدودة (كامبريدج، إنجلترا)	80-2116-30
فلتر معقم (حجم المسام: 0.22 ميكرومتر)	شركة كورنينج إنكوربوريتد (نيويورك، الولايات المتحدة الأمريكية)	431096
الفحم النشط	كارل روث GmbH & Co KG (كارلسروه، ألمانيا)	X865.2
آغار-آغار، كوبي الأول	كارل روث GmbH & Co KG (كارلسروه، ألمانيا)	5210.2
كولومبيا آجار بنسبة 5٪ دم أغنام	شركة بيكتون ديكنسون GmbH (هايدلبرغ، ألمانيا)	254005
مستخلص الخميرة	كارل روث GmbH & Co KG (كارلسروه، ألمانيا)	2363.2