عزل وزراعة البكتيريا المرتبطة بمرض Caenorhabditis elegans

الملخص

المصدر: بيترسن، سي. وآخرون، عزل وتوصيف الميكروبيوتا الطبيعية لنموذج الديدان الخيطية Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (2022)

يوضح هذا الفيديو عزل وزراعة الأنواع البكتيرية المرتبطة بمرض Caenorhabditis elegans. يمكن التحلل القائم على الخرزات ل C. elegans، يليه الزراعة الانتقائية، عزل السلالات الميكروبية المتنوعة لمزيد من التحليل.

البروتوكول

1. عزل وزراعة البكتيريا المرتبطة بالديدان الخيطية (الشكل 1)

1. لعزل البكتيريا، حضر صفيحة بسعة 96 بئر تحتوي على ثلاث خرزات معقمة بقطر 1 مم، و20 ميكرولتر من محلول M9 متوسط الأملاح المتوسطة الأدنى (M9) لكل بئر، وقم بعمل ماصة من دودة خيطية مغسولة فردية لكل بئر، مع نقل أقل قدر ممكن من السائل.
   ملاحظة: بدلا من ذلك، يمكن غسل مجموعات الديدان من الصفائح باستخدام مخزن M9، ويمكن نقل ~300 ميكرولتر من محلول M9 المحتوي على الديدان إلى أنابيب بحجم 2 مل تحتوي على 10-15 خرزة.
2. قم بتقسيم الديدان الخيطية باستخدام أداة تجانس للخرزات (مثلا، ضرب الخرز لمدة 3 دقائق عند 30 هرتز). قم بطرد مركزي على اللوحة أو الأنابيب لفترة وجيزة لنقل السائل إلى القاع (مثلا لمدة 10 ثوان عند 8000 × جرام في درجة حرارة الغرفة، RT).
   ملاحظة: أدى استخدام هذه الطريقة إلى عزل أصناف بكتيرية مشابهة لتلك التي أظهرها تسلسل أمببكونات الحمض النووي الريبوزومي 16S (rDNA)، مما يشير إلى أن ضرب الخرز الموصوف يترك معظم الخلايا البكتيرية سليمة.
3. اجمع السوبرناتانت، وقم بتخفيفه تسلسليا عند 1:10، وطبقها حتى 100 ميكرولتر على صفائح أجار بقطر 9 سم.
   1. لضمان إمكانية زراعة معظم البكتيريا، استخدم مجموعة متنوعة من الوسائط البديلة ذات المركبات الغذائية المختلفة، بما في ذلك أجار الصويا التربتيكاز المخفف (TSA، تخفيف بنسبة 1:10)، أجار ماكونكي، أجار سابورو جلوكوز، أجار ديكستروز البطاطس، أو أجار ديكستروز بالخميرة.
4. حضن الألواح في متوسط درجات الحرارة لموقع أخذ العينة (مثل درجات الحرارة بين 15-20 درجة مئوية للمناطق المعتدلة) لمدة 24-48 ساعة.
5. استخدم تقنية الثلاثة خطوط القياسية وحلقة معقمة للحصول على مزارع بكتيرية نقية (الشكل 1).
   1. اختر مستعمرة واحدة من صفيحة باستخدام حلقة معقمة أو عود أسنان وقم بتشطيرها على صفيحة أجار جديدة تحتوي على نفس وسط الأجار المستخدم في التنقية. تأكد من استخدام حوالي ثلث الطبق فقط.
   2. إما أن تستخدم حلقة معقمة جديدة أو تعقم حلقة قابلة لإعادة الاستخدام وتمررها عبر الشريط الأول لتكوين شريط ثان على ثلث آخر من نفس اللوحة.
   3. كرر هذه الخطوة بسحب حلقة معقمة عبر السلسلة الثانية.
   4. حضن الصفيحة تحت نفس ظروف النمو المستخدمة للعزل. يجب أن تؤدي هذه التقنية إلى نمو مستعمرات واحدة في منطقة السلسلة الثالثة.
      ملاحظة: قد يكون من الضروري تكرار خطوة التنقية عدة مرات لأن العزلات الطبيعية تميل إلى تكوين أغشية حيوية و/أو تجمعات.
6. ازرع المستعمرات النقية في وسط سائل (من نفس نوع وسط الأجار) باستخدام نفس درجة الحرارة ووقت النمو المذكور أعلاه (الخطوة 1.4)

النتائج

الشكل 1: تحديد الأنواع وعزلها للبكتيريا الفردية. يتم تفكيك الديدان الخيطية الفردية باستخدام موحش الخرز، ويتم عزل الحمض النووي لتحديد النوع عبر PCR أو التسلسل. بدلا من ذلك، يتم تخفيف المادة الممزقة تدريجيا وطلاء المادة الخيطية على صفائح وسط النمو....