$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
تمت مراجعة جميع الإجراءات المتعلقة بنماذج من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس مراجعة الطب البيطري في JoVE.
1. عزل مجتمع البكتيريا داخل الخلية (IBC): استخدام الماصات الفموية لخلايا IBC
ملاحظة: جميع الطرق الموضحة في هذا القسم خضعت لتقييم مخاطر مؤسسي. يحمل التسخين بالفم خطر كالحاصل على ابتلاع المحلول الذي يتم نقله. يتم تقليل هذا الخطر إلى حد كبير بفضل حجم النانولتر الذي يستخدمه هذا البروتوكول، ونوصي جميع مستخدمي البروتوكول بالانتباه إلى الملاحظات الاحترازية والممارسات المذكورة هنا وفي النقاش.
- بعد أن يتم كشط الخلايا في PBS (محلول ملحي مخزن بالفوسفات)، قم بإعداد جهاز الميكروبايبينج الفموي (الشكل 1C).
- أدخل الطرف السميك من الشعيرات الزجاجية المسحوبة (الطرف غير المسحب) في السدادة المطاطية (الطرف الأبيض) لأنبوب الشفط.
- أدخل الطرف الضيق من رأس الماصة بحجم 1 مل في الطرف الآخر المفتوح (الأحمر) من أنبوب الشفاط، لضمان ملاءمة محكمة.
- أدخل الطرف الضيق من ماصة استنشاق بحجم 2 مل في الطرف المفتوح والأعرض من طرف الماصة بسعة 1 مل، مما يضمن مرة أخرى ملاءمة محكمة.
ملاحظة: يسمح الإعداد الناتج للباحث بسحب الماصة من الطرف الأوسع والمفتوح للماصة القابلة للسحب لتوليد قوة شفط لطيفة من الطرف الضيق لأنبوب الشعيرات الدموية في الطرف الآخر من الجهاز. - اختبر جهاز الميكروبايبيتينج النهائي بالفم باستخدام طبق بتري بقطر 100 مم يحتوي على ماء منزوع الأيونات الطازج. يجب أن يؤدي فعل شفط خفيف على الطرف المفتوح للماصة الشفطة (مشابه لشرب المشروب من خلال شفاطة) إلى زيادة مستوى السائل في الشعيرات الدموية، لكنه لا يسبب تدفق الماء منزوع الأيونات إلى أنبوب الشفاط. استخدم يدا للتحكم في أنبوب الشعيرات الدموية، بينما يستخدم اليد الأخرى لضبط وضع طبق البتري.
ملاحظة: تختلف قوة الشفط المطلوبة لعمل أنبوب IBC واحد بالفم بين الباحثين. ومع ذلك، ينصح بأن يبدأ كل باحث يحاول هذه التقنية بشفط ضعيف ويزيده تدريجيا إذا لم يكن هناك سائل يتدفق إلى الأفق. لا حاجة لقوة أعظم من مص شفاطة للشرب. إذا لم يبدو أن الشعيرات الدموية تلتقط السائل أثناء الاختبار في الخطوة 1.1.4، فمن الممكن أن يكون إما الشعيرات الدموية أو أنبوب الشفط مسدودا ويحتاج إلى استبدال. كما يوصى بأن يمارس جميع الباحثين الجدد أولا التحكم في الشفط في جهاز التوصيل بالفم باستخدام ماء معقم. بالإضافة إلى ذلك، لاحظ أن التحكم في الحجم الذي يشغله جهاز مابرة الفم يتم من خلال استخدام لسان الباحث. يمكن للسان ضبط قوة الشفط بدقة، كما يعمل كتوقف طارئ. - بعد تحقيق امتصاص ناجح للسائل، اختبر القدرة على طرده من الشعيرات الدموية عن طريق النفخ بلطف في الطرف المفتوح لماصة الشفط. تأكد من عدم تكون فقاعات أثناء طرد السائل لمنع تلوث الأنابيب خلال الخطوة 1.5.
ملاحظة: كما هو الحال مع الشفط، تختلف قوة الضغط الإيجابي الذي يمارسه الباحث لطرد الأنابيب إلى أنبوب الطرد المركزي بين الباحثين. يوصى للباحثين الجدد على هذا البروتوكول بممارسة الخطوة 1.1 قبل عدة أيام من العدوى الفعلية. أحد الاقتراحات لممارسة الميكروبايبت الفموية هو التدرب على نقل كميات صغيرة من الماء المعقم ممزوجة ببضع قطرات من صبغة الطعام (للروية) باستخدام جهاز الماصة الدقيقة الفمية.
- ضع تعليق الخلية المكشطة تحت المجهر التشريحي وحدد خلايا الأجزاء اللوئية كتجمعات فلورية كبيرة (الشكل 1A، B). النطاق المثالي للتكبير هو 20-40x. اغمس الطرف الدقيق من الشعيرات الدموية الزجاجية في أنبوب جديد من PBS لمدة ثانية واحدة لتقليل امتصاص الحجم غير المرغوب فيه عبر التأثير الشعيعي.
- عند النظر من خلال المجهر، حدد الحلقة الالتهابية المعنية، واجلب ببطء الطرف المفتوح للأنبوب الشعري نحو الحلقة الالتهابية. استخدم الطرف الدقيق من الشعيرات الدموية الزجاجية لإزالة الخلايا الزائدة بالقرب من كل خلية التهابية لمنع استنشاق خليتين أو أكثر، أو لتفكيك تجمعات أكبر من الخلايا.
- أثناء النظر من خلال المجهر، قم بتطبيق قوة شفط صغيرة جدا على الطرف البعيد (الماصة الشفطية) لجهاز الميكروبايبوب في الفم لتوجيه ال IBC إلى الشعيرة الدموية الزجاجية.
- بعد التقاط الكتلة الالتهابية، انقل الشعيرات الدموية إلى أنبوب طرد مركزي فارغ بسعة 1.5 مل وطبق ضغطا إيجابيا طفيفا لطرد القطرة وأنبوب الكتلة اللوحية إلى أنبوب الطرد المركزي (الشكل 1D).
- كرر الخطوات 1.3-1.6 على المثانة الحالية حيث تحتاج إلى عدد من الأنابيب الالتهابية الالتهابية من المثانة الحالية، قبل الانتقال إلى المثانة التالية. غير الماصات والشعيرات الدموية المستنشقة بشكل متكرر لمنع تراكم اللعاب.
تحذير: عند العمل مع سلالات معدية (أو سريرية) من البكتيريا، راقب باستمرار مستوى المحلول في الشعيرات الدموية. لا تدع مستوى السائل الذي يتم ضخفه يفيض من حافة الشعيرات الدموية إلى أنبوب الشفط. إذا حدث ذلك، انتقل فورا إلى أنبوب شفط آخر، وتخلص من الإعداد السابق. - كرر الخطوات 1.2-1.6 على جميع المثانات التي تم جمعها، أو حتى يتم جمع عدد كاف من العينات البيولوجية للمجموعة التجريبية.
- (اختياري) كرر الخطوات 1.6 و1.7 حتى يتم القتل الرحيم لجميع المجموعات التجريبية (أو الفئران) ويتم جمع عينات بيولوجية كافية من كل مجموعة.
