1. تحضير البكتيريا
ملاحظة: تم عزل السلالة الشديدة النمط الثاني من Streptococcus suis (S. suis) من خنزير مريض يعاني من التهاب السحايا. تم زراعة السلالة P1/7 في مرق تود-هيويت (THB، تركيبة لكل لتر من THB: تسريب القلب، 3.1 جرام؛ نيوبتون 20.0 جرام؛ ديكستروز 2.0 جم؛ كلوريد الصوديوم 2.0 جرام؛ فوسفات الصوديوم 0.4 جرام؛ كربونات الصوديوم 2.5 جرام) وتم تغطيتها على أغار تود-هيويت (THA، الصيغة لكل لتر من THA: تسريب القلب، 3.1 جرام؛ نيوبتون 20.0 جرام؛ ديكستروز 2.0 جرام؛ كلوريد الصوديوم، 2.0 جم؛ فوسفات الصوديوم، 0.4 جرام؛ كربونات الصوديوم، 2.5 جرام؛ أغار، 15.0 جرام) عند 37 درجة مئوية و5٪ ثاني أكسيد الكربون2.
- مجموعة خلايا العوالق P1/7 السلالية
- اجمع 5 مل من خلايا العوالق من زراعة الطور اللوغاريتمية المتوسطة (OD600=0.6)، ثم استخدم الطرد المركزي لمدة 3 دقائق عند 8000 × جرام، ثم اغسله 3 مرات باستخدام محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS).
- أعد تعليق الخلايا ب 5 مل من 25٪ جليسرول في THB، ثم أقسمها إلى 5 أنابيب، ثم أخزن عند -80 درجة مئوية.
- مجموعة خلايا حالة الغشاء الحيوي P1/7
- خذ 20 مل من مزرعة النوم الليلية وأضف إلى 180 مل من THB الطازج؛ قسم الثقافة المخففة بالتساوي إلى 10 صفائح دائرية، ثم ضع الصفائح في حاضنة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربونلمدة 24 ساعة.
- بعد الحضانة، اهز الصفيحة بلطف لإعادة تعليق البكتيريا التي لم تلتصق باللوحة، ثم تخلص من المادة الفوقية عن طريق الشفط.
ملاحظة: اهز الطبق بلطف وتجنب إعادة تعليق الرواسب. - أضف 5 مل من PBS لجمع خلايا حالة الغشاء الحيوي، ثم أعد تعليق الرواسب بالكامل، ثم انقل العينة إلى أنبوب جديد.
- قم بسونيكس خلايا حالة الغشية الحيوية من الخطوة الأخيرة باستخدام المعايير التالية: 60 واط، 4 دورات، 5 ثوان تشغيل و10 ثوان إيقاف.
- استخدم الطرد المركزي لمدة 3 دقائق عند 8000 × جرام وتخزين المادة الفائقة عند -80 درجة مئوية.
ملاحظة: قد يحتوي الفائق على مكونات الغشية الحيوية، ويمكن استخدامه لإعادة تعليق بكتيريا الغشاء الحيوي قبل العدوى كما هو موضح في التجارب الحيوانية (الخطوة 2). - أعد تعليق الرواسب ب 10 مل من الجلسيرون بنسبة 25٪ في THB ثم خزن خلايا حالة الغشاء الحيوي عند -80 درجة مئوية.
2. تجارب
- استخدم فأر الإناث ب BALB/c عمرها 6 أسابيع من نوع SPF في هذه الدراسة. إصابة جميع الفئران عبر مسار العدوى تحت العنكبوتية داخل الجمجمة، حيث يقع موقع الحقن على بعد 3.5 مم من الفتحة الخلفية من البرجما.
- للتحليل النسيجي المرضي، تم إصابة مجموعتين من الفئران (5 فئران لكل مجموعة) باستخدام خلايا العوالق أو خلايا حالة الغشاء الحيوي بجرعة من 3 × 10وحدات تكوين مستعمرات (CFU)، وتم حقن 5 فئران أخرى ب PBS كضابطة.
- للكشف عن تعبير mRNA ل TLR2 والسيتوكينات في الدماغ، قم بإصابة مجموعتين إضافيتين من الفئران (6 فئران لكل مجموعة) باستخدام خلايا العوالق أو خلايا حالة الأغشية الحيوية بجرعة 3 × 107 وحدة CFU.
- حدد عدد البكتيريا الحية عن طريق طلاء التخفيفات المتسلسلة على THA.
- قم بقتل جميع الفئران بعد 12 ساعة من العدوى لمزيد من البحث.
ملاحظة: يجب إزالة الجلسرول من الوسط الأصلي قبل العدوى. يتم غسل كل من خلايا العوالق وخلايا حالة الغشاء الحيوي المستعادة من -80 درجة مئوية ثلاث مرات باستخدام PBS. ثم تعاد تعليق الخلايا العوالقة مع PBS وتخفيفها إلى الجرعة المناسبة للإصابة؛ تعاد تعليق خلايا حالة الغشاء الحيوي مع المادة الفائقة المخزنة (من الخطوة 1.2.5) وتخفيفها إلى الجرعة المناسبة للإصابة. يجب ألا يتجاوز حجم العدوى 50 ميكرولتر.
- اكتشاف تعبير mRNA ل TLR2 والسيتوكينات في أنسجة الدماغ
- استخلاص الحمض النووي الريبي الكلي من نسيج الدماغ باستخدام مجموعة استخراج RNA.
- لكل فأر، استخدم نسيج الدماغ بالكامل لاستخراج الحمض النووي الريبي. قسم نسيج الدماغ بالكامل إلى خمسة أنابيب. خذ حتى 100 ملغ من نسيج الدماغ وأضف 1 مل من محلول التحلل إلى كل أنبوب يحتوي على مصفوفة التحلل التي توفرها المجموعة.
- أعالج الأنبوب في جهاز تجانس لمدة 40 ثانية عند إعداد 6.0، ثم قم بعمل طرد مركزي على 12000 × جرام و4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق.
- بعد الطرد المركزي، انقل الطور العلوي إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد.
- حضن العينة المنقولة لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة؛ أضف 300 ميكرولتر من الكلوروفورم، ثم الدوامة لمدة 10 ثوان، ثم حضن لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- قم بعمل الطرد المركزي في الأنبوب عند 12000 × جرام و4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق. انقل الطور العلوي إلى أنبوب جديد.
- أضف 500 ميكرولتر من الإيثانول المطلق البارد إلى الأنبوب قبل قلبه خمس مرات، ثم خزن العينة عند -20 درجة مئوية لمدة ساعة على الأقل.
- قم بطرد المركزي بالأنبوب عند 12000 × جرام و4 درجات مئوية لمدة 15 دقيقة وإزالة السوبرناتانت. اغسل الحبيبة ب 500 ميكرولتر من الإيثانول البارد بنسبة 75٪ في ماء خال من RNase (H2O).
- قم بإزالة الإيثانول، وجفف الحبيبة بالهواء لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة، وأعد تعليق الحمض النووي الريبي في 100 ميكرولتر منH2O الخالي من RNase.
- حضن الحمض النووي الريبي لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة وحدد تركيز الحمض النووي الريبي باستخدام محلل حيوي للحمض النووي الريبي.
- إجراء تخليق الحمض النووي التكميلي (cDNA)، بما في ذلك إزالة الحمض النووي الجيني (gDNA)، باستخدام جهاز التدوير الحراري مع مجموعة كاشف النسخ العكسي (RT).
- أضف 1 ميكروغرام من RNA إلى أنبوب يحتوي على 2 ميكرولتر من 5x gDNA bufferbuffer، و1 ميكرولتر من إنزيم إزالة gDNA، وH2O خال من RNase حتى يصل الحجم إلى 10 ميكرولتر. حضن لمدة دقيقتين عند 42 درجة مئوية.
- أضف 10 ميكرولتر من خليط الماستر (1 ميكرولتر من خليط إنزيم RT I، و1 ميكرولتر من خليط RT Primer، و4 ميكرولتر من 5x Buffer 2، و4 ميكرولتر من H2O الخالي من RNase) إلى محلول التفاعل من الخطوة الأخيرة ثم اخلط بلطف. تابع فورا تفاعل RT: 37 °C لمدة 15 دقيقة ثم 85 °C لمدة 5 ثوان.
- قم بإجراء تحليل تفاعل بوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي (RT-qPCR) باستخدام جهاز PCR في الوقت الحقيقي مع مجموعة SYBR RT-qPCR. أضف 10 ميكرولتر من إنزيم 2x، و0.8 ميكرولتر من البرايمر الأمامي، و0.8 ميكرولتر من البرايمر العكسي، و0.4 ميكرولتر من 50x ROX Reference Dye II، و2 ميكرولتر من قالب cDNA، وH2O خال من RNase حتى يصل إجمالي الحجم إلى 20 ميكرولتر.
- شغل كل عينة على ثلاث نسخ باستخدام المعايير الحرارية التالية: 30 ثانية عند 94 درجة مئوية، تليها 40 دورة من 5 ثوان عند 95 درجة مئوية، و34 ثانية عند 60 درجة مئوية، مع مرحلة نهائية مدتها 15 ثانية عند 95 درجة مئوية، دقيقة واحدة عند 60 درجة مئوية، و15 ثانية عند 95 درجة مئوية. تم سرد بادئات RT-qPCR في الجدول 1. تم استخدام جينات التدبير المنزلي B2m و18s rRNA كعناصر تحكم داخلية.
- احسب التغير النسبي في الطية بناء على طريقة 2-ΔΔCt .
الجدول 1: مقدمات ل RT-qPCR.
| اسم البداية | التسلسل (5'-3') | رمز الجين |
| مهاجم IL-6 | CTTCCATCCAGTTGCCTTCT | Il6 |
| الخلفية IL-6 | CTCCGACTTGTGAAGTGTGATAG | Il6 |
| TLR2 إلى الأمام | CACTATCCGGGGTTGCATATC | Tlr2 |
| عكس TLR2 | GGAAGACCTTGCTGTTCTCTTAC | Tlr2 |
| CCL2 للأمام | CTCACCTGCTGCTACTCATTC | Ccl2 |
| عكس CCL2 | ACTACAGCTTTTTTGGGACAC | Ccl2 |
| TNF-α إلى الأمام | TTGTCTACTCCCAGGTTCTCT | Tnf |
| عكس TNF-α | GAGGTTGACTCTCCTGGTATG | Tnf |
| β2 متر للأمام | GGTCTCTGTGTGCTTGTCTCT | B2m |
| العكس β2m | TATGTTCGGCTTCCCATTCTC | B2m |
| 18 ثانية للأمام | GTAACCCGTTGAACCCCATT | 18 سنة rRNA |
| 18 ثانية للخلف | CCATCCAATCGGTAGTAGCG | 18 سنة rRNA |