اكتشاف التعبير الجيني المستهدف في دماغ فأر مصاب بالبكتيريا

الملخص

المصدر: تشانغ، س.، وآخرون. مسار العدوى داخل الجمجمة تحت الشفيق لدراسة أدوار أغشية المكورات العقدية السويس في التهاب السحايا في نموذج عدوى الفأر. J. Vis. Exp. (2018).

يوضح هذا الفيديو كيفية اكتشاف تعبير الجين المستهدف في دماغ فأر مصاب بالبكتيريا. يتم استخراج الحمض النووي الريبي، ومعالجته بإنزيم يحلل الحمض النووي، ثم ينسخ إلى cDNA. يتم تضخيم الحمض النووي القائم على الحمض النووي من خلال الدورة الحرارية باستخدام بادئات جينية محددة، بينما يرتبط صبغة مرتبطة بالحمض النووي المضخم، مما يصدر فلورة. يتم تحليل إشارات التألق لتأكيد وجود الجين المستهدف.

البروتوكول

1. تحضير البكتيريا

ملاحظة: تم عزل السلالة الشديدة النمط الثاني من Streptococcus suis (S. suis) من خنزير مريض يعاني من التهاب السحايا. تم زراعة السلالة P1/7 في مرق تود-هيويت (THB، تركيبة لكل لتر من THB: تسريب القلب، 3.1 جرام؛ نيوبتون 20.0 جرام؛ ديكستروز 2.0 جم؛ كلوريد الصوديوم 2.0 جرام؛ فوسفات الصوديوم 0.4 جرام؛ كربونات الصوديوم 2.5 جرام) وتم تغطيتها على أغار تود-هيويت (THA، الصيغة لكل لتر من THA: تسريب القلب، 3.1 جرام؛ نيوبتون 20.0 جرام؛ ديكستروز 2.0 جرام؛ كلوريد الصوديوم، 2.0 جم؛ فوسفات الصوديوم، 0.4 جرام؛ كربونات الصوديوم، 2.5 جرام؛ أغار، 15.0 جرام) عند 37 درجة مئوية و5٪ ثاني أكسيد الكربون_2.

1. مجموعة خلايا العوالق P1/7 السلالية
   1. اجمع 5 مل من خلايا العوالق من زراعة الطور اللوغاريتمية المتوسطة (OD₆₀₀=0.6)، ثم استخدم الطرد المركزي لمدة 3 دقائق عند 8000 × جرام، ثم اغسله 3 مرات باستخدام محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS).
   2. أعد تعليق الخلايا ب 5 مل من 25٪ جليسرول في THB، ثم أقسمها إلى 5 أنابيب، ثم أخزن عند -80 درجة مئوية.
2. مجموعة خلايا حالة الغشاء الحيوي P1/7
   1. خذ 20 مل من مزرعة النوم الليلية وأضف إلى 180 مل من THB الطازج؛ قسم الثقافة المخففة بالتساوي إلى 10 صفائح دائرية، ثم ضع الصفائح في حاضنة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون_لمدة 24 ساعة.
   2. بعد الحضانة، اهز الصفيحة بلطف لإعادة تعليق البكتيريا التي لم تلتصق باللوحة، ثم تخلص من المادة الفوقية عن طريق الشفط.
      ملاحظة: اهز الطبق بلطف وتجنب إعادة تعليق الرواسب.
   3. أضف 5 مل من PBS لجمع خلايا حالة الغشاء الحيوي، ثم أعد تعليق الرواسب بالكامل، ثم انقل العينة إلى أنبوب جديد.
   4. قم بسونيكس خلايا حالة الغشية الحيوية من الخطوة الأخيرة باستخدام المعايير التالية: 60 واط، 4 دورات، 5 ثوان تشغيل و10 ثوان إيقاف.
   5. استخدم الطرد المركزي لمدة 3 دقائق عند 8000 × جرام وتخزين المادة الفائقة عند -80 درجة مئوية.
      ملاحظة: قد يحتوي الفائق على مكونات الغشية الحيوية، ويمكن استخدامه لإعادة تعليق بكتيريا الغشاء الحيوي قبل العدوى كما هو موضح في التجارب الحيوانية (الخطوة 2).
   6. أعد تعليق الرواسب ب 10 مل من الجلسيرون بنسبة 25٪ في THB ثم خزن خلايا حالة الغشاء الحيوي عند -80 درجة مئوية.

2. تجارب

1. استخدم فأر الإناث ب BALB/c عمرها 6 أسابيع من نوع SPF في هذه الدراسة. إصابة جميع الفئران عبر مسار العدوى تحت العنكبوتية داخل الجمجمة، حيث يقع موقع الحقن على بعد 3.5 مم من الفتحة الخلفية من البرجما.
   1. للتحليل النسيجي المرضي، تم إصابة مجموعتين من الفئران (5 فئران لكل مجموعة) باستخدام خلايا العوالق أو خلايا حالة الغشاء الحيوي بجرعة من 3 × 10^وحدات تكوين مستعمرات (CFU)، وتم حقن 5 فئران أخرى ب PBS كضابطة.
   2. للكشف عن تعبير mRNA ل TLR2 والسيتوكينات في الدماغ، قم بإصابة مجموعتين إضافيتين من الفئران (6 فئران لكل مجموعة) باستخدام خلايا العوالق أو خلايا حالة الأغشية الحيوية بجرعة 3 × 10⁷ وحدة CFU.
   3. حدد عدد البكتيريا الحية عن طريق طلاء التخفيفات المتسلسلة على THA.
   4. قم بقتل جميع الفئران بعد 12 ساعة من العدوى لمزيد من البحث. ​
      ملاحظة: يجب إزالة الجلسرول من الوسط الأصلي قبل العدوى. يتم غسل كل من خلايا العوالق وخلايا حالة الغشاء الحيوي المستعادة من -80 درجة مئوية ثلاث مرات باستخدام PBS. ثم تعاد تعليق الخلايا العوالقة مع PBS وتخفيفها إلى الجرعة المناسبة للإصابة؛ تعاد تعليق خلايا حالة الغشاء الحيوي مع المادة الفائقة المخزنة (من الخطوة 1.2.5) وتخفيفها إلى الجرعة المناسبة للإصابة. يجب ألا يتجاوز حجم العدوى 50 ميكرولتر.
2. اكتشاف تعبير mRNA ل TLR2 والسيتوكينات في أنسجة الدماغ
   1. استخلاص الحمض النووي الريبي الكلي من نسيج الدماغ باستخدام مجموعة استخراج RNA.
      1. لكل فأر، استخدم نسيج الدماغ بالكامل لاستخراج الحمض النووي الريبي. قسم نسيج الدماغ بالكامل إلى خمسة أنابيب. خذ حتى 100 ملغ من نسيج الدماغ وأضف 1 مل من محلول التحلل إلى كل أنبوب يحتوي على مصفوفة التحلل التي توفرها المجموعة.
      2. أعالج الأنبوب في جهاز تجانس لمدة 40 ثانية عند إعداد 6.0، ثم قم بعمل طرد مركزي على 12000 × جرام و4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق.
      3. بعد الطرد المركزي، انقل الطور العلوي إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد.
      4. حضن العينة المنقولة لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة؛ أضف 300 ميكرولتر من الكلوروفورم، ثم الدوامة لمدة 10 ثوان، ثم حضن لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
      5. قم بعمل الطرد المركزي في الأنبوب عند 12000 × جرام و4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق. انقل الطور العلوي إلى أنبوب جديد.
      6. أضف 500 ميكرولتر من الإيثانول المطلق البارد إلى الأنبوب قبل قلبه خمس مرات، ثم خزن العينة عند -20 درجة مئوية لمدة ساعة على الأقل.
      7. قم بطرد المركزي بالأنبوب عند 12000 × جرام و4 درجات مئوية لمدة 15 دقيقة وإزالة السوبرناتانت. اغسل الحبيبة ب 500 ميكرولتر من الإيثانول البارد بنسبة 75٪ في ماء خال من RNase (H2_O).
      8. قم بإزالة الإيثانول، وجفف الحبيبة بالهواء لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة، وأعد تعليق الحمض النووي الريبي في 100 ميكرولتر من_H2O الخالي من RNase.
      9. حضن الحمض النووي الريبي لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة وحدد تركيز الحمض النووي الريبي باستخدام محلل حيوي للحمض النووي الريبي.
   2. إجراء تخليق الحمض النووي التكميلي (cDNA)، بما في ذلك إزالة الحمض النووي الجيني (gDNA)، باستخدام جهاز التدوير الحراري مع مجموعة كاشف النسخ العكسي (RT).
      1. أضف 1 ميكروغرام من RNA إلى أنبوب يحتوي على 2 ميكرولتر من 5x gDNA bufferbuffer، و1 ميكرولتر من إنزيم إزالة gDNA، وH₂O خال من RNase حتى يصل الحجم إلى 10 ميكرولتر. حضن لمدة دقيقتين عند 42 درجة مئوية.
      2. أضف 10 ميكرولتر من خليط الماستر (1 ميكرولتر من خليط إنزيم RT I، و1 ميكرولتر من خليط RT Primer، و4 ميكرولتر من 5x Buffer 2، و4 ميكرولتر من H₂O الخالي من RNase) إلى محلول التفاعل من الخطوة الأخيرة ثم اخلط بلطف. تابع فورا تفاعل RT: 37 °C لمدة 15 دقيقة ثم 85 °C لمدة 5 ثوان.
      3. قم بإجراء تحليل تفاعل بوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي (RT-qPCR) باستخدام جهاز PCR في الوقت الحقيقي مع مجموعة SYBR RT-qPCR. أضف 10 ميكرولتر من إنزيم 2x، و0.8 ميكرولتر من البرايمر الأمامي، و0.8 ميكرولتر من البرايمر العكسي، و0.4 ميكرولتر من 50x ROX Reference Dye II، و2 ميكرولتر من قالب cDNA، وH₂O خال من RNase حتى يصل إجمالي الحجم إلى 20 ميكرولتر.
      4. شغل كل عينة على ثلاث نسخ باستخدام المعايير الحرارية التالية: 30 ثانية عند 94 درجة مئوية، تليها 40 دورة من 5 ثوان عند 95 درجة مئوية، و34 ثانية عند 60 درجة مئوية، مع مرحلة نهائية مدتها 15 ثانية عند 95 درجة مئوية، دقيقة واحدة عند 60 درجة مئوية، و15 ثانية عند 95 درجة مئوية. تم سرد بادئات RT-qPCR في الجدول 1. تم استخدام جينات التدبير المنزلي B2m و18s rRNA كعناصر تحكم داخلية.
   3. احسب التغير النسبي في الطية بناء على طريقة ^2-ΔΔCt .

الجدول 1: مقدمات ل RT-qPCR.

اسم البداية	التسلسل (5'-3')	رمز الجين
مهاجم IL-6	CTTCCATCCAGTTGCCTTCT	Il6
الخلفية IL-6	CTCCGACTTGTGAAGTGTGATAG	Il6
TLR2 إلى الأمام	CACTATCCGGGGTTGCATATC	Tlr2
عكس TLR2	GGAAGACCTTGCTGTTCTCTTAC	Tlr2
CCL2 للأمام	CTCACCTGCTGCTACTCATTC	Ccl2
عكس CCL2	ACTACAGCTTTTTTGGGACAC	Ccl2
TNF-α إلى الأمام	TTGTCTACTCCCAGGTTCTCT	Tnf
عكس TNF-α	GAGGTTGACTCTCCTGGTATG	Tnf
β2 متر للأمام	GGTCTCTGTGTGCTTGTCTCT	B2m
العكس β2m	TATGTTCGGCTTCCCATTCTC	B2m
18 ثانية للأمام	GTAACCCGTTGAACCCCATT	18 سنة rRNA
18 ثانية للخلف	CCATCCAATCGGTAGTAGCG	18 سنة rRNA

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
مرق تود هيويت (THB)	بيكتون، ديكنسون وشركاه	DF0492078	قم بإذابة 30 جرام من المسحوق في 1 لتر من الماء المنقي. جهاز تعقيم على 121° لمدة 15 دقيقة.
أغار	DSBIO	16C0050	قم بإذابة 15 جرام من المسحوق في 1 لتر من THB. جهاز تعقيم على 121° لمدة 15 دقيقة.
نظام تنقية المياه المرجعي ميلي-كيو	ميرك KGaA	Z00QSVCUS	بدون Dnase/ Rnase
NaCl	شركة تيانجين كيميو للكاشف الكيميائي المحدودة	10019318
Na₂HPO₄	شركة شيلونغ العلمية المحدودة	9009012-01-09
KCl	شركة شيلونغ العلمية المحدودة	9009017-01-09
KH₂PO₄	شركة شيلونغ العلمية المحدودة	9009019-01-09
KOH	شركة شيلونغ العلمية المحدودة	9009014-01-09
الجلسرول	شركة سيونفارم للكاشف الكيميائي المحدودة	10010618	مخفف بنفس حجم الماء المنقي، ويستخدم المعقم عند 121° لمدة 15 دقيقة
4٪ بارافورمالديهيد	شركة سيونفارم للكاشف الكيميائي المحدودة	80096675
25٪ جلوتارالديهيد	شركة سيونفارم للكاشف الكيميائي المحدودة	30092436	مخفف بمقدار 10 مرات بماء منقى للتثبيت.
الإيثانول	شركة سيونفارم للكاشف الكيميائي المحدودة	10009218
الكلوروفورم	شركة سيونفارم للكاشف الكيميائي المحدودة	10006818
سبكتروفوتومتر	شركة دي نوفيكس	DS-11+
سحق الخلايا بالموجات فوق الصوتية	شركة نينغبو ساينتز للتكنولوجيا الحيوية المحدودة	JY96-IIN
الطرد المركزي	شركة هيتاشي كوكي المحدودة	CT15RE
الثلاجة	شركة أوكما المحدودة	DW-86L500
مجموعة FastRNA Pro Green	MP Biomedicals	#6045-050
جهاز فاست بريب-24	MP Biomedicals	116005500
أداة لجهاز PCR	شركة سينسو كويست GmbH	1124310110
كوانتستوديو 6 فليكس	ثيرمو فيشر العلمي	4485689
SYBR بريمكس إكس تاك II	شركة تاكارا للتكنولوجيا الطبية الحيوية (بكين) المحدودة	RR820A
مجموعة كاشف RT من PrimeScript مع ممحاة gDNA	شركة تاكارا للتكنولوجيا الطبية الحيوية (بكين) المحدودة	RR047A