اكتشاف التعبير الجيني المستهدف في دماغ فأر مصاب بالبكتيريا

الملخص

المصدر: تشانغ، س.، وآخرون. مسار العدوى داخل الجمجمة تحت الشفيق لدراسة أدوار أغشية المكورات العقدية السويس في التهاب السحايا في نموذج عدوى الفأر. J. Vis. Exp. (2018).

يوضح هذا الفيديو كيفية اكتشاف تعبير الجين المستهدف في دماغ فأر مصاب بالبكتيريا. يتم استخراج الحمض النووي الريبي، ومعالجته بإنزيم يحلل الحمض النووي، ثم ينسخ إلى cDNA. يتم تضخيم الحمض النووي القائم على الحمض النووي من خلال الدورة الحرارية باستخدام بادئات جينية محددة، بينما يرتبط صبغة مرتبطة بالحمض النووي المضخم، مما يصدر فلورة. يتم تحليل إشارات التألق لتأكيد وجود الجين المستهدف.

البروتوكول

1. تحضير البكتيريا

ملاحظة: تم عزل السلالة الشديدة النمط الثاني من Streptococcus suis (S. suis) من خنزير مريض يعاني من التهاب السحايا. تم زراعة السلالة P1/7 في مرق تود-هيويت (THB، تركيبة لكل لتر من THB: تسريب القلب، 3.1 جرام؛ نيوبتون 20.0 جرام؛ ديكستروز 2.0 جم؛ كلوريد الصوديوم 2.0 جرام؛ فوسفات الصوديوم 0.4 جرام؛ كربونات الصوديوم 2.5 جرام) وتم تغطيتها على أغار تود-هيويت (THA، الصيغة لكل لتر من THA: تسريب القلب، 3.1 جرام؛ نيوبتون 20.0 جرام؛ ديكستروز 2.0 جرام؛ كلوريد الصوديوم، 2.0 جم؛ فوسفات الصوديوم، 0.4 جرام؛ كربونات الصوديوم، 2.5 جرام؛ أغار، 15.0 جرام) عند 37 درجة مئوية و5٪ ثاني أكسيد الكربون_2.

1. مجموعة خلايا العوال....

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
مرق تود هيويت (THB)	بيكتون، ديكنسون وشركاه	DF0492078	قم بإذابة 30 جرام من المسحوق في 1 لتر من الماء المنقي. جهاز تعقيم على 121° لمدة 15 دقيقة.
أغار	DSBIO	16C0050	قم بإذابة 15 جرام من المسحوق في 1 لتر من THB. جهاز تعقيم على 121° لمدة 15 دقيقة.
نظام تنقية المياه المرجعي ميلي-كيو	ميرك KGaA	Z00QSVCUS	بدون Dnase/ Rnase
NaCl	شركة تيانجين كيميو للكاشف الكيميائي المحدودة	10019318
Na₂HPO₄	شركة شيلونغ العلمية المحدودة	9009012-01-09
KCl	شركة شيلونغ العلمية المحدودة	9009017-01-09
KH₂PO₄	شركة شيلونغ العلمية المحدودة	9009019-01-09
KOH	شركة شيلونغ العلمية المحدودة	9009014-01-09
الجلسرول	شركة سيونفارم للكاشف الكيميائي المحدودة	10010618	مخفف بنفس حجم الماء المنقي، ويستخدم المعقم عند 121° لمدة 15 دقيقة
4٪ بارافورمالديهيد	شركة سيونفارم للكاشف الكيميائي المحدودة	80096675
25٪ جلوتارالديهيد	شركة سيونفارم للكاشف الكيميائي المحدودة	30092436	مخفف بمقدار 10 مرات بماء منقى للتثبيت.
الإيثانول	شركة سيونفارم للكاشف الكيميائي المحدودة	10009218
الكلوروفورم	شركة سيونفارم للكاشف الكيميائي المحدودة	10006818
سبكتروفوتومتر	شركة دي نوفيكس	DS-11+
سحق الخلايا بالموجات فوق الصوتية	شركة نينغبو ساينتز للتكنولوجيا الحيوية المحدودة	JY96-IIN
الطرد المركزي	شركة هيتاشي كوكي المحدودة	CT15RE
الثلاجة	شركة أوكما المحدودة	DW-86L500
مجموعة FastRNA Pro Green	MP Biomedicals	#6045-050
جهاز فاست بريب-24	MP Biomedicals	116005500
أداة لجهاز PCR	شركة سينسو كويست GmbH	1124310110
كوانتستوديو 6 فليكس	ثيرمو فيشر العلمي	4485689
SYBR بريمكس إكس تاك II	شركة تاكارا للتكنولوجيا الطبية الحيوية (بكين) المحدودة	RR820A
مجموعة كاشف RT من PrimeScript مع ممحاة gDNA	شركة تاكارا للتكنولوجيا الطبية الحيوية (بكين) المحدودة	RR047A