يوضح هذا الفيديو توصيل الفطر السلي (Mtb) عبر الرذاذ إلى الفئران باستخدام نظام حجري قائم على جهاز التنشيح لتحفيز العدوى الرئوية، موفرا نموذجا مضبوطا وقابلا للتكرار لدراسة انتقال السل الجوي وتفاعلات المضيف مع الممرض في الجسم الحي.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
توصيل الرذاذ لمتسربات السل لعلاج عدوى رئوية في نموذج فأر
638 مشاهدة
⸱
فبراير 2, 2026
في هذه المقالة
الملخص
البروتوكول
تمت مراجعة جميع الإجراءات المتعلقة بنماذج من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس مراجعة الطب البيطري في JoVE.
1. عدوى الهباء الجوي للفئران ب MtB باستخدام غرفة جلاس-كول
أفضل طريقة لتوحيد عدوى الهباء الجوي لدى التجريبية المصابة ب mtb (متفطرة السل) هي استخدام البكتيريا الفطرية من مخزونات مجمدة ذات عيارات معروفة لوحدات تكوين المستعمرات. لتحضير زراعة المخزون، يتم اتخاذ تدابير لتجنب تكتل البكتيريا في ميدلبروك 7H9 مع وسط تخصيب OADC (حمض الأوليك، الألبومين، الدكستروز، الكاتالاز) و0.05٪ Tween 80، وهو مصدر كربوني للفطريات، واتخاذ تدابير لتجنب تكتل البكتيريا في نفس الوقت. يجب أن يكون لدى المزارع كثافة بصرية (OD) ≤ 1 وقت الحصاد. عند ارتفاع جرعة زائدة، يزداد تكتل البكتيريا وتنخفض قابلية البقاء. تخزين 1 مل من الليكوات عند -80 درجة مئوية. حدد عدد الألياف الكيميائية الصالحة في المخزون المجمد عن طريق طلاء سلسلة من التخفيف بمقدار 10 مرات لثلاث قوارير مستقلة على ألواح 7H11 Agar مع إضافة 0.5٪ جلسرول، 1 جرام/لتر أسباراجين، وOADC وتعداد المستعمرات بعد 4 أسابيع من الحضانة عند 37 °م. قم بإجراء عدوى الهباء الجوي كما هو موضح أدناه.
- قم بإذابة مخزونات Mtb من عيار CFU المعروف وامزج التعليق بعناية خمس مرات لنشر الكتل البكتيرية باستخدام حقنة بسعة 1 مل مزودة بإبرة 27 جالون. تجنب إنتاج الهباء الجوي.
- اعتمادا على الجرعة المرغوبة من العدوى، انقل الحجم المطلوب من مخزون الفطريات إلى أنبوب بحجم 50 مل يحتوي على محلول ملحي معقم مخبأ بالفوسفات (PBS). المجلد النهائي هو 6 مل.
ملاحظة: من خلال تغيير عدد الكائنات الدقيقة في هذا التعليق، يتم تغيير نسبة البكتيريا الحاملة لقطرات الهباء الجوي. عادة ما نهدف إلى امتصاص 100 عصية صالحة لكل رئة (عدوى بجرعة منخفضة). من خلال تجربتنا، يتطلب ذلك حوالي 1-2 × 10إلى 6 طن ميغاتي/مل في حجم إجمالي يبلغ 6 مل، منها 5.5 مل متسخمة. يوصى بإجراء سلسلة من تحديات الهباء الجوي التجريبي مع تركيزات مختلفة من البكتيريا للعثور على الظروف المثالية للعدوى. بينما يمكن إجراء عدوى بجرعات عالية مع ما يصل إلى 5000 فطرية لتسريع العملية المعدية، يمكن استخدام ما لا يقل عن 5 بكتيريا لإصابة الفئران بنجاح عبر الجذارة. معدل العدوى عادة 100٪.
- إزالة حجم كاف (تم تحضيره أكثر من الحجم النهائي المطلوب) للطلاء لتحديد عيار اللقاح؛ عادة ما نزيل 500 ميكرولتر إلى الطلاء الثلاثي التقني.
- ضع في سلة شبكية مقسمة (فأر واحد لكل سلة) داخل غرفة الهباء الجوي الدائري وأغلق غطاء غرفة الهباء الجوي.
ملاحظة: النماذج الأخرى مجهزة بسلة على شكل فطيرة مكونة من خمسة أقسام منفصلة، كل منها يمكن أن يتسع ل 20 فأرا.
- قم بتثبيت وحدة فينتوري-نيبولايزر على وصلات الثلاثة من الفولاذ المقاوم للصدأ.
- قم بإزالة التعليق الفطري من أنبوب 50 مل باستخدام حقنة 10 مل مزودة بإبرة 18 جرام حادة واحمل الحقنة إلى غرفة الهباء الجوي في صندوق نقل مغلق.
- قم بإزالة غطاء المسمار في وحدة جهاز الريخة وحقن تعليق البكتيريا المتفطرة بحذر في جهاز البخاخ. تجنب توليد الهباء الجوي. تخلص من الحقنة في حاوية حادة تحتوي على 2٪ بوراتون. أغلق جهاز التنشاق بغطاء اللولبي.
- شغل مفتاح الطاقة الرئيسي ومصباح الأشعة فوق البنفسجية. تعرض الشاشة على لوحة التحكم "شركة Glas-Col Apparatus Co".
- شغل مفتاح البرنامج. سيظهر العرض "هل جهاز التنشاخ جاهز؟" "هل السلة محشوة؟" اضغط Enter عندما تكون جاهزا". اضغط إدخال.
- تظهر الشاشة "دخول وقت ما قبل التسخين 900"؛ وهذا يعني أن وقت التسخين المسبق للمحرقة (التي تطهير الهواء العادم) هو 900 ثانية. اضغط Enter.
- سيظهر العرض "دخول زمن التبخير 1,800"؛ هذا يعني أن وقت التنفير مضبوط على 1,800 ثانية كوضع افتراضي. لتمديد وقت التنصيب، أدخل "2,400" واضغط إدخال.
ملاحظة: خلال دورة التبخير، يقوم الهواء تحت الضغط بتجزئة التعليق، مما ينتج قطرات صغيرة تحتوي على البكتيريا الفطرية. مع تدفق الهواء الرئيسي، تحمل هذه القطرات (بحجم حوالي 2-5 ميكرومتر) إلى غرفة الهباء الجوي.
- سيظهر العرض "ادخل وقت التوقيت 1800"؛ هذا يعني أن دورة التحلل تستغرق 1800 ثانية. اضبط على "2,400" واضغط على إدخال.
ملاحظة: خلال هذه الدورة، يمكن أن تتحلل السحابة التي تراكمت في غرفة الهباء الجوي أثناء دورة التلخيص. تستنشق التجريبية القطرات الصغيرة.
- سيظهر العرض "أدخل وقت ديسمبر 900"؛ هذا يعني أن دورة إزالة التلوث بضوء الأشعة فوق البنفسجية ستستغرق 900 ثانية. اضغط إدخال. سيبدأ الجهاز بالدوران عبر التسخين المسبق، والتلخيص السحابي، وتحلل السحب، وإزالة التلوث بالأشعة فوق البنفسجية.
تحذير: يجب أن يشير مقياس تدفق الفراغ إلى 60 قدم مكعب/ساعة (تحقق من بدء دورة التسخين المسبق؛ اضبط صمام التحكم في التفريغ إذا لزم الأمر) ومقياس تدفق الهواء المضغوط 10 أقدام مكعب/ساعة (تحقق عند بدء دورة التفريغ؛ اضبط صمام التحكم في الهواء وفقا لذلك). - عند اكتمال الدورة، ستظهر لوحة المفاتيح "اكتملت العملية – إزالة العينة". أوقف البرنامج، الأشعة فوق البنفسجية، ومفتاح الطاقة الرئيسي.
- تحقق مما إذا كان تعليق الفطر قد تم تفريغه بالكامل وإذا لم يكن كذلك، سجل الحجم المتبقي بإزالة التعليق بعناية باستخدام حقنة مناسبة مزودة بإبرة غير حادة بوزن 18 جالون. يجب ألا يكون الحجم المتبقي أكثر من 1 مل.
- أزل جهاز التنشاق من المفاصل وضعه في مقلاة تحتوي على 2٪ بوراتون لمدة لا تقل عن ساعتين، وعادة ما يتم التعقيم باستخدام الخصم. بعد ذلك، انقل جهاز البخاخ إلى مقلاة جديدة وشطفها جيدا بالماء. اترك جهاز التنشيط ليجف بالهواء.
- افتح غرفة الهباء الجوي وأعد إلى أقفاصها. ضع السلال في أكياس الأوتوكلاف والمعقم الصناعي. امسح سطح داخل غرفة الهباء الجوي ب 2٪ من البوراتون.
ملاحظة: لأسباب تتعلق بالسلامة، يجب ارتداء جهاز تنفس هواء يعمل بالطاقة أثناء هذه الإجراءات.
- باستخدام ال 500 ميكرولتر المتبقية من نظام التعليق الفطري (انظر الخطوة 1.3)، يتم تخفيف الألواح بمقدار 10 طيات من ثلاثي التقنية (3 × 100 ميكرولتر) على صفائح أجار 7H11.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| بوراتون | شولكه | المكونات الفعالة: ألدهيدات (فورمالديهايد، جلوتارالديهايد، أوكسالديهايد، إيثيل سداسي) | |
| ميدلبروك 7H9 | سيغما | M0178 | لمزارع مرق الجبال |
| ميدلبروك 7H11 | بكالوريوس العلوم الحيوية | 283810 | وسط الأجار لثقافة الدراجات الجبلية |
| وسيط إثراء OADC في ميدلبروك | بكالوريوس العلوم الحيوية | 212240 | أضف إلى 7 حواط 9 و7 11 لثقافة الدراجات الجبلية |
| نظام التعرض للاستنشاق | غلاس-كول | ||
| نيبولايزر-فينتوري | غلاس-كول |
