تصوير التوهج الحيوي للعدوى البكتيرية في الفئران

الملخص

المصدر: دي فريس، سي. آر. وآخرون، نموذج تطعيم متأخر لعدوى جرح زائف الزائفة المزمنة . J. Vis. Exp. (2020).

يعرض هذا الفيديو تقنية تصوير متوهج حيويا لمراقبة تقدم العدوى البكتيرية في نموذج فأر حي. البكتيريا الممرضة التي تم هندستها باستخدام نظام الإبلاغ luxABCDE تصدر ضوءا في موقع العدوى، مما يسمح برؤية البكتيريا النشطة أيضيا. من خلال تصوير الفأر على مر الزمن، يمكن للباحثين تتبع ديناميكيات العدوى بشكل غير جراحي وقياس شدة الإشارات المضيئة الحيوية.

البروتوكول

1. تحضير ونمو البكتيريا

1. قم بجميع الأعمال مع P. aeruginosa التي تستخدم احتياطات BSL-2 وفقا لإرشادات لجنة السلامة البيولوجية المؤسسية ولجنة استخدام للباحث. قم بجميع الخطوات الموصوفة هنا المتعلقة ب P. aeruginosa، بما في ذلك تطعيم الفئران، في خزانة السلامة البيولوجية.
2. سلالة PAO1:lux المتوهجة من P. aeruginosa متوفرة من مختبرنا عند الطلب. سلسلة من PAO1، مخزنة كمخزون جلسريوم مجمد، على أجار مرق الليسوجيني (LB). بالنسبة لسلالة PAO1:lux المتوهجة، يجب أن يحتوي أجار LB على مضادات حيوية انتقائية (100 ميكروغرام/مل كاربينيسيلين و12.5 ميكروغرام/مل كاناميسين). انمو عند 37 درجة مئوية طوال الليل في حاضنة بكتيريا.
3. اختر مستعمرة معزولة ونمو طوال الليل عند 37 درجة مئوية في وسط 3 مل رطل، ودرجة حموضة 7.4. بالنسبة للسلالات المضيئة، يجب أن يحتوي المرق على 100 ميكروغرام/مل من الكاربينيسيلين. نما تحت ظروف الاهتزاز والهوائية.

2. تحضير الإجراءات

1. اطلب من جميع الطاقم إجراء الجراحة ارتداء رداء نظيف/معطف مختبر، وقناع وجه، وشبكة شعر، وقفازات.
2. استخدم جميع الأدوات الجراحية، بما في ذلك المقص والملاقط، على المعقم الجسدي. استخدم تقنية المعقمة لتعقيم الأدوات بين.
3. نظف طاولة الجراحة بالإيثانول وجهز ساحة جراحية نظيفة.

3. إزالة الشعر

1. قم بتخدير فئران C57BL/6J التي تتراوح بين 8–12 أسبوعا باستخدام 1٪–3٪ إيزوفلوران. يجب على الباحثين اتباع إرشادات الأطباء البيطريين في مؤسساتهم للتخدير عند استخدام الإيزوفلوران.
   1. ابدأ التخدير بإعطاء إيزوفلوران بنسبة 1٪–3٪ وضبط معدل تدفق الأكسجين إلى 1.5 لتر/دقيقة. ضع الفأر في غرفة الحث.
   2. اضغط على إصبع قدم الفأر لتقييم عمق التخدير. عندما لا يستجيب الفأر للتحفيز، أخرجه من غرفة الحث وضعه على الطاولة الجراحية مع وجود أنفه في مخروط أنف إيزوفلوران.
   3. ضع مزلق العين على كلتا العينين.
2. زن الفأرة للحصول على وزن أساس قبل العملية.
3. ضع الفأر في وضعية الاستلقاء. حقن الفأر تحت الجلد بكلوريد الصوديوم المعقم 0.9٪ المسخن مسبقا، 250 ميكرولتر على كل جانب ليصبح المجموع 500 ميكرولتر.
4. احلق المنطقة الظهرية للفأر باستخدام ماكينة حلاقة كهربائية. يجب أن يتم الحلاقة في مكان مختلف عن محطة الجراحة لمنع تلوث الشعر في الجرح.
5. ضع طبقة رقيقة من لوشن إزالة الشعر. دع الكريم يبقى لمدة 20–60 ثانية. أزل الشعر واللوشن الزائد باستخدام الشاش المرطب في ماء دافئ. بعد إزالة الشعر، تابع إجراء جرح الاستئصال.

4. جراحة جرح استئصال كامل السماكة

1. حقن البوبرينورفين بإفران مستمر 0.6–1 ملغ/كغ تحت الجلد باستخدام إبرة 25 جرام في منتصف الظهر من الفأر. يوفر البوبرينورفين بطيء الإطلاق تخفيف الألم خلال 48–72 ساعة.
2. عقم موقع الجراحة. امسح السطح الظهري بمسحة بيتادين معقمة. امسح كمية البيتادين الزائدة بمسحة كحولية معقمة. يجب إجراء ذلك ثلاث مرات (بالتناوب بين البيتادين والكحول)، مع مسح القطعة عن طريق التحرك من المركز بشكل دائري إلى الحافة. دع المنطقة تجف بالهواء.
3. قم بإنشاء ستارة حول موقع الجراحة باستخدام شاش معقم أو لفافة بلاستيكية.
4. شد الجلد بقوة من الخلف. استخدم ثقب خزعة الجلد المعقم بقطر 6 مم لعمل شق أولي عبر البشرة الظهرية اليسرى. كرر العملية على البشرة الظهرية اليمنى.
5. استخدم الملقط لتثبيت الجلد من مركز منطقة الجرح المحددة على اليسار. قم بإزالة طبقات البشرة والجلد باستخدام المقص. كرر العملية على منطقة الجرح المحددة على الجانب الأيمن لتكوين جروح استئصالية متناظرة.
6. اغسل الجروح بمحلول ملحي معقم بسعة 50 ميكرولتر. اترك موقع الجراحة والجلد المحيط يجف في الهواء. ثم غط الجروح والظهر بضمادة شفافة من الطبق.
7. أعد الفأر إلى قفص نظيف. منزل واحد لكل قفص.
8. ضع القفص على وسادة تدفئة وشاشة حتى يستيقظ الفأر.
9. عند إجراء الجراحة السابقة على عدة، استخدم معقم خرز ساخن لتنظيف جميع الأدوات الجراحية بين.
10. اترك 24 ساعة للفئران للتعافي من العملية الجراحية ولتكوين مصفوفة جرح مؤقتة فوق الجروح قبل الانتقال إلى التطعيم بالبكتيريا.

5. التطعيم ب P. aeruginosa

1. قم بتخفيف مزرعة PAO1:lux الليلة إلى OD600 = 0.05 في 75 مل من وسط LB يحتوي على 100 ميكروغرام/مل كاربينيسيلين وانمو البكتيريا حتى تدخل الزراعة المرحلة الأسية المبكرة (OD₆₀₀ ≈ 0.3). يجب أن يستغرق هذا حوالي ساعتين إلى ثلاث ساعات.
2. PAO1 المخفف: لوكس في PBS إلى تركيز (7.5 ± 2.5) ×^{10 2} CFU/mL. تأكد من تحضير اللقاح الزائد لضمان الحجم الكافي وللسماح للتحضير بعد التجربة. إذا كنت تنقل بين المنشآت (أي من المختبر إلى المخزن الحيوي)، استخدم احتواء مزدوج في صندوق مقاوم للتسرب وعليه علامة بيولوجية واضحة.
3. قم بجميع الأعمال مع P. aeruginosa والفئران باستخدام معدات الحماية الشخصية المعتمدة في خزانة السلامة البيولوجية المعتمدة من مستوى السلامة البيولوجية للحيوان (ABSL-2) (BSC). يجب تغطية المعدات القابلة لإعادة الاستخدام، مثل ميزان الوزن، بلفافة لاصقة لمنع التلوث.
4. قم بالتخدير باستخدام إيزوفلوران بنسبة 3٪ كما هو موضح أعلاه. زن الفأرة وسجل الوزن. حقن الفأر تحت الجلد بكلوريد الصوديوم المعقم 0.9٪ المسخن مسبقا، 250 ميكرولتر على كل جانب ليصبح المجموع 500 ميكرولتر.
5. إذا كانت طبقة الغلاف الشفافة من الفأر قد أزلت طوال الليل، قم بإزالة أي قشرة ناتجة بعناية ووضع ضمادة جديدة.
6. استخدم حقنة أمان بسعة 500 ميكرولتر من التيوبركولين 27 جيلون لحقن 40 ميكرولتر من تعليق PAO1:lux عبر ضمادة الفيلم الشفاف في كل جرح. يجب استخدام فئران مختلفة للتحكم في الجروح غير الملقحة أو PBS لمنع التلوث المتبادل من الجانب المقابل.
7. أعد الفأرة إلى قفصها على وسادة تدفئة وشاشة حتى تستيقظ. يجب أن توضع جميع الفئران بشكل فردي في أقفاص منفصلة لمنع التلوث المتبادل.
8. قدم معجون مكمل غذائي عالي السعرات المحصور بين حبيبات الطعام على أرضية القفص.
9. استخدم اللقاح المتبقي لوضع صفيحة أجار على LB. عد المستعمرات لتأكيد عدد البكتيريا التي تم إعطاؤها.

6. التصوير الحية للجروح المصابة

1. اتبع بروتوكولات احتواء BSL-2 لنقل الفئران من وإلى جهاز التصوير، بما في ذلك استخدام حاوية ثانوية. كن حذرا من نقل أو إسقاط أي فراش حيواني أثناء نقل الفأر إلى غرفة الحث أو جهاز التصوير.
2. تحفز تخدير الفأر مع استنشاق 1٪ – 3٪ من الأيزوفلوران في غرفة التحفيز.
3. بعد تخدير الفأر، وضعه في وضع الاستلقاء في غرفة التصوير لنظام التصوير البصري بحيث يكون الأنف في مخروط الأنف الإيزوفلوراني.
4. افتح البرنامج التلفزيوني.
5. تختلف معايير الاكتساب بناء على عدد التي تم تصويرها في نفس الوقت وشدة التلألؤ الحيوي. تشمل المعايير الأساسية التي يجب ضبطها وقت التعريض، التقطيع، التوقفات (f/stop)، ومجال الرؤية (FOV). إعدادات البداية الافتراضية لدينا هي زمن التعريض 30 ثانية، والتقليل من الزاوية (2)، والتوقفات 1.2، ومجال الرؤية 25. قم بضبط هذه الإعدادات حسب الحاجة، حسب احتياجات الباحث.
6. تحليل بيانات التلميع باستخدام برنامج تصوير. سيتم تمثيل التوهج كصورة شبه ملونة موضوعة على صورة ملونة للفئران.
   1. أنشئ منطقة اهتمام (ROI) في موقع الجرح وقس متوسط التدفق (فوتونات/ثانية) المكتشف. لاحظ أنه يمكن أيضا الإبلاغ عن البيانات كإشعاع (فوتونات/ثانية/سم²/ستيراديان)، ولكن طالما أن مسافة منصة التصوير عن الكاميرا تبقى ثابتة بين التصوير، فإن التدفق كاف.
   2. قس الخلفية عن طريق إنشاء عائد على الاستثمار في منطقة عشوائية على منصة التصوير. اطرح عدد الفوتونات في الخلفية في الثانية.
   3. تصدير البيانات إلى جدول بيانات لمزيد من التحليل.
7. قم بإجراء التصوير كما هو موضح أعلاه بشكل متكرر يوميا لتتبع تقدم العدوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
حقن كلوريد الصوديوم بنسبة 0.9٪	هوسبيرا	2484457
إبرة معقمة بحجم 18 G × 1	BD	305195
إبرة معقمة 25 G × 1 1/5	BD	305127
مسحة كحولية	BD	326895
برنامج تصوير الهالة	تصوير الأجهزة الطيفية	لا يوجد
البيتادين	شركة بيردو فريدريك	19-065534
مختبر بوبرينورفين SR	زوفارم	لا يوجد
فئران ذكر C57BL/6J	مختبر جاكسون	664
ثقب خزعة يمكن التخلص منه، 6 ملم	إنتيجرا	33-36
مقص دقيق - كربيد التنجستن	أدوات العلوم الدقيقة	14568-09
معقم جاف بحبيبات الزجاج	جهاز هارفارد	61-0183
الأجار المحبب	كواشف فيشر الحيوية	BP9744
وسادة التدفئة	ميليارد	804879481218
حقنة الأنسولين بإبرة 28 جرام	BD	329461
نظام تصوير لاغو إكس	تصوير الأجهزة الطيفية	لا يوجد
مرق LB	كواشف فيشر الحيوية	BP1426
حقنة ليور-لوك بسعة 1 مل	BD	309628
ماكينة قص ميني آركو	والل بروفيشنال	919152
لوشن إزالة الشعر ناير مع زيت الأطفال	تشيرش ودوايت	لا يوجد	متوفر في أي صيدلية
ملقط مثمن الأضلاع	أدوات العلوم الدقيقة	11041-08
طبق بتري	فالكون	351029
محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) مرة واحدة	كورنينغ	21-040-CV
غلاف الضغط والختم	سعيد	لا يوجد
حقنة الإنسولين SafetyGlide بإبرة 30 جرام	BD	305934
حقنة Safetyglide بمحقنة الأنسولين، نصف مل، 30 جرام × 5/16 تيرايت	BD	305934
الحجم	أوهاوس سكاوت برو	SP202
المكملات الغذائية التكميلية	هنري شاين لصحة	29908
تيجاديرم، 6 سم × 7 سم	3M	1624W