تحديد مجموعة محددة من بكتيريا الأمعاء في البعوض البالغ

الملخص

المصدر: ليو، إكس، وآخرون. اختبار تغذية بكتيري فموي باستخدام البعوض المعالج بالمضادات الحيوية. J. Vis. Exp. (2020)

يظهر هذا الفيديو استنزاف ميكروبيوتا الأمعاء الأصلية في البعوض باستخدام محلول السكروز يحتوي على مضاد حيوي. يتبع ذلك إعادة استعمار محكومة مع تعليق بكتيريا يتم توصيله عبر نظام تغذية غشائي لتحديد مجموعة بكتيرية محددة في أمعاء البعوضة.

البروتوكول

1. العلاج بالمضادات الحيوية وإعادة إدخال البكتيريا

1. حضر محلول المضاد الحيوي.
   1. وزن الكمية المطلوبة من السكروز، البنسلين، والستريبتوميسين لتحضير محلول سكروز بنسبة 10٪ يشمل 20 وحدة من البنسلين و20 ميكروغرام من الستربتوميسين لكل مل.
2. أطعم البعوض بمحلول المضاد الحيوي.
   1. قم بتخدير البعوض على حرارة 4 درجات مئوية لمدة 3–5 دقائق. انقل البعوض إلى كوب ورقي. غط الغطاء بالشاش وغلف الشاش بشريط لاصق لمنع هروب البعوض.
   2. اغمس كرات القطن المعقمة في محلول المضاد الحيوي وضعها بعناية على كوب البعوض. اضغط على كرات القطن قبل استخدامها لمنع البعوض من الغرق في كرات القطن المتساقطة.
   3. غط كرات القطن بطبق بترى بقطر 10 سم لمنع تبخر الرطوبة. استبدل كرات القطن مرتين يوميا لمدة ثلاثة أيام متتالية.
3. تحضير التعليق البكتيري
4. قس المحلول البكتيري باستخدام مقياس طيفي. أضف تعليق بكتيريا واحد من OD (OD₆₀₀₀) إلى أنبوب بحجم 1 مل. قم بعمل نظام التعليق المركزي عند 5,000 × g لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
5. تخلص من المادة الفائقة وأضف 1 مل من مخزن PBS المعقم 1x إلى أنبوب 1.5 مل لترسيب التعليق.
6. الطرد المركزي عند 5,000 × g لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية؛ تخلص من السوبرناتانت.
7. كرر الخطوات 2.4.2 و2.4.3.
8. أضف 200 ميكرولتر من محلول ملحي معقم 1x مخزن فوسفات (PBS) إلى الترسب البكتيري.
9. أضف 600 ميكرولتر من محلول السكروز بنسبة 10٪، و200 ميكرولتر من أدينوزين 5′-ثلاثي الفوسفات (ATP) بعيار 10 مم، و200 ميكرولتر من التعليق البكتيري في أنبوب معقم بسعة 1.5 مل. امزج عن طريق الدوامة.
10. أطعم البعوضة بتعليق البكتيريا.
    1. جوع البعوض لمدة 24 ساعة، مما يسمح للمضادات الحيوية بالاستقلاب قبل تغذية البكتيريا.
    2. قم بتجميع نظام تغذية الغشاء.
    3. أغلق وحدة التغذية المعقمة بغشاء بارا فيلم أو بدلا من ذلك، غشاء كولاجين.
    4. ضع حلقة بلاستيكية وثبتها بفيلم بارا لتجنب الانكسار بسبب الاحتكاك أثناء التغذية.
    5. أضف المحلول البكتيري المحضر ببطء إلى وحدة التغذية.
       ملاحظة: يمكن ملء بئر واحد فقط من وحدة التغذية ذات البئرين بالمحلول، وتغطية وحدة التغذية فقط من جانب الإسقاط الكيميائي.
    6. توصيل وحدة التغذية بنظام تغذية مسخن مسبقا إلى 37 درجة مئوية، مما يحاكي درجة حرارة الإنسان لجذب البعوض. ضع جهاز التغذية على كوب ورقي مليء بالبعوض وأطعمه لمدة 90 دقيقة.
    7. بعد التغذية، قم بتخدير البعوض بتعريضه لدرجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة 3–5 دقائق والحفاظ على تخديره في طبق بتري بارد جدا.
    8. قطف البعوض المنتفخ بالكامل لمزيد من الدراسات.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
أدينوزين 5′-ثلاثي الفوسفات ثنائي الصوديوم هيدرات الملح	سيغما	A2383	تم استخدام هيدرات أدينوزين 5′-ثلاثي الفوسفات ثنائي الصوديوم في تحضير المحاليل القياسية لثلاثي الفوسفات الأدينوزيني (ATP)
نظام تغذية غشاء الهيموتيك	هيموتيك		مكونات نظام التغذية، بما في ذلك وحدة تحكم حرارة هيموتيك، مجموعة غلاف المغذي، المغذي المعدني المجمع.
بارافيلم	سانغون بيوتيك	F104002	4 إنش × 125 قدم
طبق بتري	سانغون بيوتيك	F611203
البنسلين G بروكاين ملح الهيدرات	سانغون بيوتيك	A606248	مسحوق أبيض. قابل للذوبان في الماء، قابل للذوبان في الميثانول، قابل للذوبان قليلا في الماء، الإيثانول
كبريتات الستربتوميسين	سانغون بيوتيك	A610494	ستربتوميسين كبريتات هو مضاد حيوي للجلوكوزامين يتداخل مع تخليق البروتينات بدائية النواة.
سكروز	سانغون بيوتيك	A502792	قابلة للذوبان في الماء والإيثانول والميثانول، وقابلة للذوبان قليلا في الجلسرول والبيريدين.
مخزن PBS 10X	سانغون بيوتيك	E607016	هذا المنتج هو حل 10X. يرجى تخفيفه 10 مرات قبل الاستخدام. قيمة الرقم الهيدروجيني هي 7.4.