التصوير الحي لموت الخلايا البلعمية أثناء العدوى الميكوبكتيرية في أجنة سمك الزرد

الملخص

المصدر: نيو، إل.، وآخرون. تصور موت الخلايا الهلبية البلعمية أثناء العدوى الميكوبكتيرية في أجنة سمك الزرد عبر المجهر الحيوي. J. Vis. Exp. (2019)

يوضح هذا الفيديو استخدام المجهر الكونفوكي داخل الحياة لتصوير موت الخلايا الليتية البلعمية في أجنة سمك الزرد بعد عدوى فطرية المارينوم .

البروتوكول

1. تصوير مباشر للعدوى

1. 1. تركيب الأسماك للتصوير الحي
   1. انقل ما يصل إلى 10 أجنة مخدرة بالتريكائين إلى منتصف طبق زجاجي مقاس 35 مم. تخلص من كمية إضافية من E3 متوسط.
   2. غط الطبق ب 1٪ من الأجاروز منخفض النقطة ووجه أجنة سمك الزرد بعناية باستخدام إبرة 10 جرام. حضن الطبق الزجاجي السفلي على الثلج لمدة 10 ثوان لتصلب الأغاروز.
      ملاحظة: لحقن الدماغ المتوسط، يجب تركيب الأجنة في الأغاروز مع توجيه الرأس للأعلى (الشكل 1A).
   3. بمجرد أن يتجمد تماما، غط الأجاروز بطبقة من ماء البيض (بالإضافة إلى 1 x تريكائين وPTU (N-فينيل ثيوريا)).
2. المجهر الكونفوكي عالي الدقة بثلاثة ألوان مع تايم لابس
   ملاحظة: يتم إجراء الخطوات التالية على مجهر كونفوكالي مزود بعدسة UV ذات زيت 63.0x1.40.
   1. اضبط درجة حرارة غرفة البيئة على 28.5 درجة مئوية. ضع بعض ورق المناديل الرطب داخل الحجرة لتوفير الرطوبة ومنع تبخر ماء البيضة.
   2. ضع الطبق الزجاجي السفلي بحجم 35 مم مع سمك الزرد في غرفة البيئة.
   3. افتح برنامج الكونفوكال وقم بتهيئة المرحلة. انتقل إلى هدف الأشعة فوق البنفسجية بحجم 63.0 × 1.40 وحدد موقع سمك الزرد باستخدام قناة الحقل الساطع مع فلتر التداخل التفاضلي (DIC).
   4. افتح دايود 405، وأرجون (قوة 20٪)، وليزر DPSS 561 نانومتر. قم بإعداد إعدادات الطاقة والطيف المناسب للليزر.
      ملاحظة: فيما يلي إعدادات الطيف لسيروليان (الإثارة = 405 نانومتر؛ الانبعاث = ~456–499 نانومتر)، eGFP (الإثارة = 488 نانومتر؛ الانبعاث = ~500–550 نانومتر)، DsRed2 (الإثارة = 561 نانومتر؛ الانبعاث = ~575–645 نانومتر)
   5. اختر وضع الاستحواذ "XYZ" و"المسح التسلسلي" وضبط تنسيق الصورة على "512 × 512 بكسل".
   6. انتقل إلى "وضع البيانات الحية". استهدف موقع أول سمكة زرد وحدد موقعي "ابدأ" و"نهاية" في Z. كرر هذه العملية لكل جنين متبق. يمكن إضافة "توقف" في نهاية البرنامج.
   7. حدد الحلقة ودورة البرنامج.
   8. احفظ الملف.

النتائج

الشكل 1: تركيب أجنة سمك الزرد للتصوير الحي. (أ) لعلاج عدوى الدماغ المتوسط، كانت أجنة سمك الزرد تركب ورؤوسها موجهة للأسفل. (ب) بالنسبة لعدوى منطقة الجذع، تم تركيب أجنة سمك الزرد بشكل جانبي مع موقع الحق...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
طبق زجاجي مقاس 35 مم	إن فيترو ساينتيفك	D35-10-0-N
أغاروز	سانغون بيوتيك	A60015
المجهر الكونفوكال	لايكا	TCS SP5 II
غرفة البيئة	بيكون	التحكم في الحرارة 37-2 رقمي
الميكروبكتيريوم مارينوم			ATCC BAA-535
N-فينيل ثيوريا (PTU)	سيغما	P7629