التقييم الصناعي لقتل البكتيريا بواسطة الخلايا البلعمية الطحالية للفئران الوليدة

الملخص

المصدر: سيمان، ب. ج.، et.al. نموذج تصوير حديثي الولادة لتعفن البكتيريا سالب الجرام. J. Vis. Exp. (2020)

يوضح هذا الفيديو عزل العدلات والخلايا الأحادية الالتهابية من طحال الفئران الوليدية وتطبيقها في اختبار قتل البكتيريا المتوهج. يشمل التفكك الميكانيكي، وتحليل خلايا الدم الحمراء، وإثراء الخلايا المعتمدة على الخرزات المغناطيسية، وحضانة البكتيريا، والحماية بالمضادات الحيوية. تشير قراءات التلميع الزمنية إلى استيعاب البكتيريا الأولي تليها إزالة مناعية.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات المتعلقة بعينات والموافقة عليها من قبل لجنة مراجعة أخلاقيات المختصة.

1. اختبار قتل البكتيريا في المختبر

1. قم بإزالة الطحال من جرو حديث الولادة غير المصاب وضعه في سلة نايلون بحجم 40 ميكرومتر داخل طبق بتري معقم بحجم 60 مم. كرر ذلك وجمع الطحال في أنبوب واحد ليحصد ويتجانس معا.
2. أضف 5 مل من محلول ملحي مخبأ بالفوسفات (PBS) مع 10٪ مصل أبقار جنيني (FBS).
3. قم بتفكيك الأنسجة باستخدام مكبس حقنة معقمة بسعة 3 مل حتى يتم إنشاء تعليق خلية واحدة.
4. اجمع التعليق أحادي الخلية خارج سلة النايلون، وانقل إلى أنبوب طرد مركزي بسعة 15 مل، وخلايا الحبيبات بقوة 350 × جرام لمدة 5 دقائق.
5. الخلايا في مخزن تحلل خلايا الدم الحمراء (2 مل لما يصل إلى 7-8 طحال) واتركها واقفة لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة للقضاء على كريات الدم الحمراء.
6. اغسل الخلايا الطحالية باستخدام PBS والحبيبات كما في الأعلى.
7. الخلايا الطحالية في 0.25 مل من PBS مع إضافة 0.5٪ BSA و2 mM EDTA وفقا لإنتاج الخلايا المتوقع.
8. عد الخلايا الطحالية باستخدام جهاز قياس الدم أو أي تطبيق مناسب آخر.
9. عزل خلايا Ly6B.2⁺ (مجموعة الخلايا الحبيبية/الخلايا الأحادية الالتهابية) التي تحتوي على حبيبات مغناطيسية مناعية.
10. خليا بذور Ly6B.2⁺ بكثافة 1 × 10⁵ خلايا لكل بئر في صفيحة سوداء أو بيضاء من 96 بئر في حجم 0.1 مل من DMEM تحتوي على 10٪ FBS، 2 ملليمولار جلوتامين، و25 ملليمولار HEPES (وسط كامل).
11. قم بتعداد الإشريكية القولونية المتوهجة حيويا وتحضير اللقاح البكتيري عند التعددية المطلوبة للعدوى (MOI) في حجم نهائي 0.1 مل. أفضل ما يتم ذلك هو صنع ما هو ضروري لجميع الآبار في MOI مشترك على دفعة.
12. أضف 0.1 مل من اللقاح البكتيري أو وسط كامل فقط كوسيلة تحكم. حضن لوحة الحفر المتعددة عند 37 درجة مئوية و5٪ ثاني أكسيد الكربون_{لمدة ساعة} واحدة.
13. استبدل الوسط ب 0.2 مل من الوسائط الكاملة الطازجة التي تحتوي على جنتاميسين (100 ميكروغرام/مل) عن طريق إزالة الوسائط بلطف باستخدام ماصة وإضافة وسائط جديدة برأس ماصة جديد. أعد الزراعة إلى مرحلة الحضانة لمدة ساعتين إضافيتين.
14. بعد 3 ساعات من العدوى، قس التلميع في كل بئر من لوح الزراعة المغلق من الأسفل باستخدام قارئ الألواح ثم أعد الزراعة إلى مرحلة الحضانة.
15. تكرار قياسات التلمعان في نقاط زمنية مرغوبة أخرى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
مخزن تحليل ACK	جيبكو	LSA1049201	اختبار إزالة البكتيريا
حبيبات مضادة ل-Ly-6B.2 الدقيقة	ميلتيني بيوتيك	130-100-781	عزل الخلايا
الإشريكية القولونية O1:K1:H7-lux (يعبر عن لوسيفيراز)	لا يوجد	لا يوجد	تم بناؤها داخليا في WVU
مخزن العزل	ميلتيني بيوتيك	لا يوجد	اختبار إزالة البكتيريا
إل بي بروت، لينوكس	كواشف فيشر الحيوية	BP1427-500	نمو البكتيريا
مصفاة EASYstrainer (سلة نايلون)	غرينر بيو-ون	542 040	مصفاة الخلايا
سبيكترا ماكس iD3	الأجهزة الجزيئية	لا يوجد	قارئ الألواح