نمذجة العدوى في الفئران حديثة الولادة باستخدام بكتيريا متوهجة حيويا مغلفة

الملخص

المصدر: سيمان، ب. ج.، وآخرون. نموذج تصوير حديثي الولادة لتعفن البكتيريا سالب الجرام. J. Vis. Exp. (2020)

يعرض الفيديو نموذج فأر حديثي الولادة لدراسة العدوى الجهازية باستخدام بكتيريا مضيئة حيوية مغلفة. يتم حقن الجراء حديثي الولادة بجرعات عالية أو منخفضة من معلقات بكتيرية وتعاد إلى أمهاتهم للرعاية بعد الولادة. البكتيريا المغلفة تتجنب الكشف المناعي المبكر، وتنتشر بشكل نظامي، ويتم رؤيتها مع مرور الوقت باستخدام التصوير التلميعي. يتيح هذا النموذج تتبع تقدم العدوى بشكل غير جراحي لدى الفئران حديثة الولادة.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات المتعلقة بنماذج من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس مراجعة الطب البيطري في JoVE.

1. تحضير لقاح البكتيريا

1. شريط من صفيحة الصويا التريبتيكية (TSA) مع حلقة تلقيح لعزل مستعمرة واحدة من مخزون المجمد من الإشريكية القولونية O1:K1:H7-lux التي تعبر بشكل مستقر عن لوسيفيراز وتحمل مقاومة الكاناميسين. حضن الحوض طوال الليل عند درجة حرارة 37 درجة مئوية.
2. في اليوم التالي، دع مرق لوريا (LB) يصل إلى درجة حرارة الغرفة (25 درجة مئوية) في خزانة السلامة البيولوجية.
3. تحت غطاء خزانة السلامة البيولوجية، حدد مستعمرة واحدة من الصفيحة المخططة وتلقيحها بسعة 3 مل من LB مع إضافة الكاناميسين (30 ميكروغرام/مل). حضانة الحوض طوال الليل عند 37 درجة مئوية مع الرج بسرعة 220 دورة في الدقيقة (دورة في الدقيقة). هذه هي ثقافة المبتدئين.
4. قم بتخفيف زراعة البداية بمقدار 1:100 إلى 3 مل من LB تحت غطاء خزانة السلامة الحيوية وأعدها إلى الحاضنة لمدة 2-3 ساعات عند 37 درجة مئوية مع الرج (220 دورة في الدقيقة). هذه هي ثقافة المخزون.
5. اقرأ الكثافة البصرية (OD) لكل من الزراعة الفارغة والمخزون عند 600 نانومتر باستخدام مقياس طياف. أضف 100 ميكرولتر من LB (لا يحتوي على بكتيريا) إلى بئر واحد من صفيحة اختبار مسطحة القاع بسعة 96 بئئ؛ هذا هو الفراغ. ثم أضف 100 ميكرولتر من الزراعة الأصلية إلى بئر منفصل. كرر ذلك لتكرارين إضافيين. يتم قراءة الامتصاص باستخدام قارئ اللوحة.
6. اطرح الامتصاص الفارغ من قيمة امتصاص الزراعة (قيمة التوزيع الزائد) وقارن مع منحنى نمو تم إنشاؤه والتحقق منه سابقا لتحديد تقريب كثافة البكتيريا في مزرعة المخزون لتحضير الجرعة المعدية.
7. قم بتوليد لقاح مستهدف حسب سؤال البحث. تم استخدام اللقاح المستهدف بحجم 2 × 10⁶ (منخفض) و7 × 10⁶ (عالي) وحدات تكوين مستعمرات (CFUs) لكل فأر (/فأر) في هذه الدراسة.
   1. اقسم الجرعة المستهدفة لكل فأر (DoseT) على التركيز المقدر للبكتيريا في مزرعة المخزون (Stock) للحصول على حجم البكتيريا المطلوبة من أنبوب المخزون (VS).
   2. اضرب VS في عدد الفئران (NM) التي تحتاج إلى إصابة، بالإضافة إلى ما يكفي ل 5-10 جرعات إضافية، لإجمالي كمية البكتيريا المطلوبة للعدوى، بالإضافة إلى 5-10 جرعات إضافية. أزل هذا الحجم من أنبوب التركيب وأضفه إلى أنبوب طرد مركزي جديد.
   3. استخدم المعادلة أدناه: جرعة/مخزون = VS × NM = الحجم الكلي (VT) للبكتيريا التي يجب إزالتها من أنبوب المخزن.
8. قم بطرد المركزي للبكتيريا عند 2000 x جرام لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية وإعادة تعليق الحبيبات البكتيرية في 50 ميكرولتر من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) (درجة حموضة 7.2-7.6) لكل فأر ليصاب (مثلا، في 10 جرعات من 2 × 10⁶ بكتيريا في كل جرعة، يتم تعليق حبيبة 2 × 10⁷ بكتيريا في 500 ميكرولتر PBS). مرة أخرى، ينصح بتحضير كمية أكبر من اللقاح مما هو مطلوب. حضر كمية مماثلة من PBS فقط للتطعيمات الضابطة. حافظ على اللقاح المعدي ومكافحة PBS على الجليد حتى العدوى.
9. قم بعمل سبع تخفيفات متسلسلة بمقدار عشرة مرات إلى PBS في صفيحة تخفيف بلاستيكية ذات قاع بسعة 96 بئئر، وطبق بحجم 25 ميكرولتر من التخفيفات مكررة على ألواح TSA رباعية مدعومة بالكاناميسين (30 ميكروغرام/مل) لتعداد الكمية الفعلية للبكتيريا المعطاة. حضانة عند 37 درجة مئوية خلال الليل لتكوين المستعمرة قبل التعداد.

2. تحديد هوية

1. رتب عددا كافيا من أزواج التكاثر بحيث يمكن مزامنة الجراء مع الجراء المتطابقة في الأعمار. التغير العمري ± يوم واحد مقبول.
2. تحديد أنثى فأرة حامل من نوع C57BL/6 وراقب ولادة الجراء قبل التجربة المخطط لها لتحديد العمر بدقة.
3. للتمييز بين الجراء المصابة والصغار المصابين الذين يبلغ عمرهم 3 أو 4 أيام، استخدم زوجا من مقصات القزحية الصغيرة ذات الأطراف الدقيقة لقص أطراف ذيول الجراء الضابطة فقط. الجراء المصابة لا تتلقى مقصات الذيل. قبل قص الذيل، قم بتعقيم الجلد بكرة قطنية مغموسة بنسبة 70٪ إيثانول. اضغط على نهاية الذيل باستخدام كرة قطنية أو شاش حسب الحاجة.
   ملاحظة: يتم إجراء هذه العملية تحت غطاء خزانة السلامة البيولوجية. قص ذيل بطول حوالي 1/8 بوصة يكفي.
4. لتحديد الجراء ضمن المجموعة الضابطة والمصابة، استخدم حقنة أنسولين بسعة 1 مل مع إبرة دائمة بحجم 28 جرام × 1/2'' لوشم ذيول الجراء. قبل الوشم، قم بتعقيم الجلد بكرة قطنية مغموسة بنسبة 70٪ إيثانول. يتم إجراء هذه العملية تحت غطاء خزانة السلامة البيولوجية.
5. لوشم الذيل، ضع حبر وشم على طرف الإبرة. بعد ذلك، قيد الجرو بعناية بيد واحدة، مع كشف ذيله بالكامل. أدخل الإبرة بلطف تحت الجلد مع الحفاظ على عمق سطحي، وحرك الإبرة موازية الجلد عدة مليمترات حتى يتم تكوين علامة صغيرة أو نقطة. انتظر بضع ثوان قبل إزالة الإبرة ببطء من تحت الجلد، لتجنب إخراج الحبر الزائد من تحت الجلد.
6. اضغط على الجرح بكرة قطنية أو شاش حسب الحاجة. أزل الحبر الزائد من سطح الجلد باستخدام 70٪ إيثانول.
7. كرر هذه العملية مع الفئران التالية في المجموعتين المصابة والمجموعة الضابطة، مع إضافة نقطة إضافية مع كل جرو متتالي موشم (مثلا، الجرو 1 سيكون لديه نقطة واحدة على ذيله، والجرو 2 لديه نقطتان على ذيله، وهكذا).
   ملاحظة: لإضافة طبقة إضافية من التعرف، ينصح باستخدام ألوان منفصلة من حبر وشم للمجموعات الضابطة والمصابة.

3. التلقيح تحت لوح الكتف

ملاحظة: في هذه الدراسة، أجريت تجربتان مع مجموعة جرعات منخفضة وعالية مخصصة لكل تجربة. في التجربة الأولى، تم إعطاء 7 جراء اللقاح بجرعة منخفضة (تم استخدام 4 جراء كعناصر تحكم)، وتم إعطاء 5 جراء من جرعة منفصلة جرعة عالية (تم استخدام 3 جراء كجرعات ضابطة). الجراء من التجربة الأولى قدموا بيانات فقط لنقطة زمنية 24 ساعة. في التجربة الثانية، تم إعطاء 8 جراء اللقاح بجرعة منخفضة (تم استخدام جروين كجراء ضابطة)، و6 جراء تم إعطاء اللقاح عالي الجرعة (تم استخدام جروين كجراء ضابطة). قدمت الجراء من التجربة الثانية بيانات لنقاط التوقيت 0 و10 و24 ساعة.

1. الجراء ≤ يوم واحد من المطابقة العمرية. خصص كل جثة إما بجرعة منخفضة أو عالية. داخل الجمع، قم بتعيين الجراء عشوائيا كجرو متحكم أو جرو مصاب.
2. في اليوم الثالث أو الرابع بعد الولادة، سجل أوزان جميع الجراء قبل التلقيح بإشريكية قولونية أو جهاز التحكم في PBS. افصل السد عن الجراء خلال هذه الفترة لضمان عدم تحريكهم أثناء العدوى.
3. داخل خزانة السلامة الحيوية باستخدام إبرة الأنسولين، استنشق إما PBS أو لقاح E. coli-lux . لهذا العمل، تم استخدام حقن 2 × 10⁶ و7 × 10⁶ CFU لكل فأرة. احتفظ بكل من اللقاح المعدي ومتلازمة PBS على الثلاجة حتى يتم إعطاؤها عبر الحقن تحت الكتف.
4. ضع الطفل الجديد على سطح نظيف في غطاء خزانة السلامة البيولوجية وارفع الجلد عند مؤخرة الرقبة كما لو كنت تمسك الجرو.
5. في المساحة التي تنشأ الآن بين الجلد وعضلة، أدخل الإبرة، وارفع الحافة تحت الجلد مباشرة، وحقن 50 ميكرولتر من PBS أو E. coli-lux. في الوقت نفسه، أطلق الجزء المضغوط من الجلد لمنع التدفق العكسي للحقن.
6. أزل الإبرة ببطء وبعناية. أعد الجراء إلى الأم بعد الانتهاء من الحقن. ملاحظة: نظرا لمرحلة التشريح في تطورها، من الناحية التقنية إعطاء الوريد الذيلي أو حقن داخل الصفاق للجراء الوليدية في اليوم الثالث أو الرابع. لذا، تم اختيار مسار العدوى تحت الكتف لهذه الدراسة بسبب سهولة التنفيذ.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
حقنة الأنسولين بسعة 1 مل	كوفيدين	1188128012	حقن اللقاح أو حقن PBS
معجون حبر وشم	كاتشوم	KI1482039	تحديد
وشم بالحبر الأخضر	كاتشوم	KI1471039	تحديد
الإشريكية القولونية O1:K1:H7	ATCC	11775
الإشريكية القولونية O1:K1:H7-lux (يعبر عن لوسيفيراز)	لا يوجد	لا يوجد	تم بناؤها داخليا في WVU
DPBS، 1X	كورنينغ	21-031-CV
ديفكو تريبتيك صويا أغار	بيكتون، ديكنسون وشركاه	236950	نمو البكتيريا
برنامج IVIS Spectrum CT وLiving Image 4.5	بيركين إلمر	لا يوجد	التصوير داخل الحيوية
إل بي بروت، لينوكس	كواشف فيشر الحيوية	BP1427-500	نمو البكتيريا