الكشف الميداني عن البكتيريا في أقسام أنسجة لثة الفئران

الملخص

المصدر: تشوي، ي. س. وآخرون. الكشف في الموقع عن البكتيريا داخل الأنسجة المدمجة في البارافين باستخدام مسبار DNA موسوم بالديجوكسين يستهدف 16S rRNA. J. Vis. Exp. (2015).

يوضح هذا الفيديو الكشف الميداني عن البكتيريا في مقاطع أنسجة اللثة للفئران باستخدام مجسات DNA موسومة بالديجوكسين تستهدف الحمض النووي البكتيري. يتم حضن القسم مع المجس. تضاف الأجسام المضادة المقترقة بالفوسفاتاز القلوي الخاصة بالديجوكسين. يتم تعطيل الفوسفاتازات الداخلية، ويتم الحصول على ترسيب ملون عن طريق إضافة الركيزة. يتم صبغ المقطع معاكس، وتجفيفه، وتطهيره بالزيلين، وتركيبه قبل الرؤية المجهرية للبكتيريا.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات المتعلقة بعينات والموافقة عليها من قبل لجنة مراجعة أخلاقيات المختصة.

1. تحضير المجسات

1. تضخيم PCR للمسبار
   1. بالنسبة للمسبار الخاص ب Porphyromonas gingivalis، قم بتضخيم جزء DNA بطول 343 قطعة من P. gingivalis 16S rRNA بواسطة PCR باستخدام الحمض النووي الجينومي ل P. gingivalis والبادئات التالية: 5'- TGC، AAC، TTG، CCT، TAC، AGA، GG-3' و5'- ACT CGT، ATC، GCC، CGT، TAT، TAT TC-3'. قم بإجراء تضخيم بظروف الدورة التالية: 35 دورة عند 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، 60 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، و72 درجة مئوية لمدة دقيقة و20 ثانية، تليها تمديد لمدة 5 دقائق عند 72 درجة مئوية.
   2. تضخيم....

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
أنهيدريد الخليك	سيغما	6404
محلول كبريتات ديكستران 50٪	ميليبور	S4030
حل 50X دينهاردت	سيغما	D2532
الديإيثيل بيروكربونات (DEPC)	سيغما	P159220
مجموعة وسم وكشف الحمض النووي Digoxigenin (DIG)	روش	11 093 657 910
الفوراميد	سيغما	F9037
قلم إم إدج™	داكو	H-400
ليفاميسول	المسار	SP-5000
كلوريد المغنيسيوم	سيغما	246964
حمض الماليك	سيغما	M0375
ميثيل أخضر	سيغما	M6776
بارافورمالديهايد	سيغما	P1648
بيرمونت	فيشر	SP15-500
محلول الحمض النووي للحيوانات المنوية في السلمون	إنفيتروجين	#15632-011
كلوريد الصوديوم	سيغما	S9625
سترات الصوديوم	دوكسان	D1420
كبريتات الصوديوم الدوديسيل	أمريسكو	227
ثلاثي إيثانولامين-HCl	سيغما	90279
تريس-HCl	البحث العضوي	3098T