الكشف الميداني عن البكتيريا في أقسام أنسجة لثة الفئران

الملخص

المصدر: تشوي، ي. س. وآخرون. الكشف في الموقع عن البكتيريا داخل الأنسجة المدمجة في البارافين باستخدام مسبار DNA موسوم بالديجوكسين يستهدف 16S rRNA. J. Vis. Exp. (2015).

يوضح هذا الفيديو الكشف الميداني عن البكتيريا في مقاطع أنسجة اللثة للفئران باستخدام مجسات DNA موسومة بالديجوكسين تستهدف الحمض النووي البكتيري. يتم حضن القسم مع المجس. تضاف الأجسام المضادة المقترقة بالفوسفاتاز القلوي الخاصة بالديجوكسين. يتم تعطيل الفوسفاتازات الداخلية، ويتم الحصول على ترسيب ملون عن طريق إضافة الركيزة. يتم صبغ المقطع معاكس، وتجفيفه، وتطهيره بالزيلين، وتركيبه قبل الرؤية المجهرية للبكتيريا.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات المتعلقة بعينات والموافقة عليها من قبل لجنة مراجعة أخلاقيات المختصة.

1. تحضير المجسات

1. تضخيم PCR للمسبار
   1. بالنسبة للمسبار الخاص ب Porphyromonas gingivalis، قم بتضخيم جزء DNA بطول 343 قطعة من P. gingivalis 16S rRNA بواسطة PCR باستخدام الحمض النووي الجينومي ل P. gingivalis والبادئات التالية: 5'- TGC، AAC، TTG، CCT، TAC، AGA، GG-3' و5'- ACT CGT، ATC، GCC، CGT، TAT، TAT TC-3'. قم بإجراء تضخيم بظروف الدورة التالية: 35 دورة عند 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، 60 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، و72 درجة مئوية لمدة دقيقة و20 ثانية، تليها تمديد لمدة 5 دقائق عند 72 درجة مئوية.
   2. تضخيم المسبار اليوبكتيريا باستخدام شظية DNA بطول 70 قطعة شعر (5'-CAGGTGCTGCATGTGTGTGTGTGAATGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTCCCCAACGAGGCAACCC-3') تم تصنيعها كأوليغونيوكليوتيد والمواد البادئية التالية: 5'-CAG GTR CTG CMT GGY-3' و5'-AGG GTT GCG CTC GTT-3'. قم بإجراء تضخيم بشروط الدورة التالية: 40 دورة عند 94°C لمدة 30 ثانية، 60 °م لمدة 30 ثانية، و72 درجة مئوية لمدة دقيقة و20 ثانية، تليها تمديد لمدة 5 دقائق عند 72 درجة مئوية.
   3. قم بترسيب منتجات PCR (≥500 ميكرولتر) بإضافة 3 M أسيتات الصوديوم (pH 5.2) و100٪ إيثانول (بنسبة 10:1:2) وحضانة عند -20 درجة مئوية لمدة ساعتين.
   4. قم بعمل طرد مركزي للخليط عند 14,000 x g لمدة 15 دقيقة، وإعادة تعليق الحبيبات في 100 ميكرولتر من حمض تريس-إيثيلين إيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA) أو مخزن TE، وقياس تركيز الحمض النووي بالكثافة البصرية عند 260 نانومتر.
2. وسم ديجوكسيجينين (DIG) باستخدام مجموعة وسم وكشف الحمض النووي الخاصة ب DIG
   1. اخلط 3 ميكروغرام من المجس مع الماء إلى حجم نهائي 15 ميكرولتر.
   2. قم بتغيير طبيعة الحمض النووي عند 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ثم استرخي بسرعة على الثلج.
   3. أضف 2 ميكرولتر من خليط سداسي النيوكليوتيدات 10x، و2 ميكرولتر من خليط وسم ثلاثي الفوسفات (dNTP) ديأوكسينيوكليوزيد، و1 ميكرولتر من إنزيم كلينو إلى 15 ميكرولتر من الحمض النووي المفكك.
   4. اخلط وحضن على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 24 إلى 48 ساعة، وأوقف التفاعل بتسخين عند 65 درجة مئوية.
3. تحقق من حساسية المسبار الموسوم ب DIG باستخدام مجموعة وسم وكشف الحمض النووي الخاص ب DIG
   1. تحميل يدويا 1 ميكرولتر من التخفيف التسلسلي لمسبار التحكم الإيجابي المقدم في المجموعة و1 ناغرام من المجس الموسوم ب DIG على غشاء النايلون وجففه لمدة 5 دقائق عند درجة حرارة الغرفة (RT).
   2. انقع الغشاء لفترة وجيزة في محلول مؤقت من سترات الصوديوم المالحة (SSC) (0.3 M كلوريد الصوديوم أو NaCl، 30 ملليمول سترات الصوديوم، pH 7.0) وحضن الغشاء عند 80 درجة مئوية لمدة ساعة لتثبيت الحمض النووي.
   3. انقع الغشاء لفترة وجيزة في محلول حمض الماليك (MAB، 0.1 مليون حمض الماليك، 0.15 مليون NaCl، pH 7.5) وحضن الأجسام المضادة المضادة للفوسفاتاز القلوي المضاد ل DIG (AP) المخفف (1:5,000) في 6 مل من محلول الانسداد المقدم في مجموعة RT لمدة 30 دقيقة.
   4. اغسل الغشاء ب MABT (يحتوي على 1٪ Tween 20) وطبق 40 ميكرولتر من محلول نيترو-بلو تترازوليم/5-برومو-4-كلورو-3'-إندوليل فوسفات (NBT/BCIP) ممزوج بمحلول كشف 2 مل (0.1 M تريس(هيدروكسي ميثيل)أمينوميثان هيدروكلوريد أو Tris-HCl، 0.1 M NaCl، 0.05 M كلوريد المغنيسيوم أو MgCl₂، pH 9.5) على الغشاء لمدة دقيقة واحدة. إذا لم تكن حساسية المجس الموسوم مرضية، كرر الخطوات من 1.1.3 إلى 1.3.4.
   5. قس تركيز الحمض النووي للمسبار الموسوم (OD₂₆₀) واضبط التركيز إلى 100 نانوغرام ميكروليتر-1.
4. تحقق من خصوصية المسبار الموسوم ب DIG
   1. عينات الحمض النووي الجينومية غير الطبيعية (25 نانوغرام 3 ميكرولتر لكل عينة) من أنواع بكتيرية مختلفة، بما في ذلك البكتيريا المستهدفة من قبل المسبار المحدد، عند درجة حرارة 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق وتبرد بسرعة على الثلج.
   2. قم بتحميل الحمض النووي المغير الطبيعة يدويا على غشاء النايلون وجففه لمدة 20 دقيقة عند RT.
   3. انقع الغشاء لفترة وجيزة في حاجز SSC مرتين وحضانة الغشاء عند 80 درجة مئوية لمدة ساعتين لتثبيت الحمض النووي.
   4. قم بإغلاق الغشاء بمحلول حاجب عند RT لمدة ساعة واحدة.
   5. قم بتخفيف المجس عند 1 نانوغرام ميكروليتر-1 في مخزن التهجين، وإزالة طبيعة المجسات المخففة، وتطبيقها على الغشاء.
   6. حضن الغشاء عند 45 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.
   7. اغسل الغشاء ثلاث مرات باستخدام مخزن SSC مرتين فقط.
   8. انقع الغشاء لفترة وجيزة في MAB.
   9. حضن بجسم مضاد DIG مرتبط ب AP مخفف (1:2,000) في 6 مل من محلول الانسداد عند RT لمدة ساعة واحدة.
   10. اغسل الغشاء ب MABT وطبق 40 ميكرولتر من محلول NBT/BCIP ممزوجا مع محلول كشف بحجم 2 مل.
   11. عندما لا يحقق المسبار الخصوصية المتوقعة، قم بزيادة درجة حرارة التهجين حتى يتم ملاحظة الخصوصية.

2. التهجين في الموقع

ملاحظة: لتجنب جفاف العينات والكواشف، أجر جميع الحضانات في غرفة رطبة مبطنة بمناشف ورقية مبللة.

1. إزالة البارافين وإعادة ترطيب مقاطع الأنسجة
   1. جهز 4 أقسام نسيج بسماكة ميكرومتر من كتل مغموسة بالبارافين. الفورمالين، والبارافورمالديهايد، والمثبتات القائمة على الزنك متوافقة مع هذا البروتوكول.
   2. حضر جميع المواد الكيميائية باستخدام مياه معالجة بمادة الديثيل بيروكربونات (DEPC).
   3. تدفئ السحب في فرن جاف على حرارة 60 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة وتقوم بالحضانة على RT لمدة 30 دقيقة.
   4. انزلاق غمر في 100٪ زيلين لمدة 5 دقائق ثلاث مرات؛ استخدم الزيلين الطازج في كل مرة.
      ملاحظة: قم بإجراء إزالة الشمع هذا باستخدام غطاء بخار كيميائي.
   5. اغمر العينات في 100٪ إيثانول لمدة 5 دقائق مرتين، باستخدام الإيثانول الطازج في كل مرة، وأعد ترطيب العينات في محاليل 90٪، 80٪، و70٪ إيثانول متسلسلة لمدة 5 دقائق لكل واحدة.
   6. اغمر شرائح في ماء معالج ب DEPC لمدة دقيقة واحدة، وغسل شرائح في محلول ملحي معالج بالفوسفات أو PBS (درجة حموضة 7.4) المعالجة ب DEPC لمدة 6 دقائق.
2. المعالجات المسبقة لمقاطع الأنسجة
   1. اغمر شرائح في حمض هيدروكلوريك بقوة 0.1 نيوتن لمدة 20 دقيقة، وغسل شرائح في ماء معالج ب DEPC لمدة 30 ثانية.
   2. ارسم حاجزا كاره للماء حول العينات باستخدام قلم شمع.
      ملاحظة: حجم الحاجز الكاره للماء يعتمد على حجم العينات. لذلك، تختلف أحجام المواد المستخدمة في الخطوات التالية حسب حجم العينات، لكنها يجب أن تملأ الحاجز الكاره للماء (50 ميكرولتر للعينات الصغيرة و400 ميكرولتر للعينات الكبيرة).
   3. عالج العينات ب 50 إلى 400 ميكرولتر من بروتيناز K (1 إلى 10 ميكروغرام ^مل-1 في PBS المعالجة ب DEPC) في فرن جاف عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة وغسل شرائح في 1x PBS معالجة ب DEPC لمدة دقيقة واحدة.
   4. انقع شرائح في 4٪ بارافورمالديهايد في PBS المعالجة ب DEPC لمدة 10 دقائق، ثم غسل السلايدات في PBS المعالجة ب DEPC لمدة دقيقة واحدة.
   5. نقع شرائح في 0.1 متر من ثلاثي إيثانول أمين-HCl (درجة حموضة 8.0) تحتوي على 0.5٪ أنهيدريد أسيتيك لمدة 20 دقيقة، وشرائح غسل في ماء معالج ب DEPC لمدة 30 ثانية.
3. التهجين مع المجس والغسل
   1. اغمر الشرائح في مخزن SSC مرتين لمدة 20 دقيقة.
   2. تخفيف المسبار عند 1 نانوغرام ^{ميكروليتر-1} في مخزن التهجين (4x SSC، 50٪ فوراميد [فوليوم/فول]، 1x محلول دينهاردت، 10٪ [وزن لكل فول] دكستران سلفات، 0.1٪ [وزن لكل فول] صوديوم دوديسيل كبريتات، 0.4 ملغ 1 ملليتر-1 حمض نووي لحيوانات السلمون المنوية للسلمون). بالنسبة للضوابط السلبية، اخلط المجس الموسوم مع كمية زائدة بمقدار 10 أضعاف من المجس غير المعنون.
   3. قم بإزالة طبيعة المجسات المخففة وتطبيق 50 إلى 400 ميكرولتر على أقسام الأنسجة. ضع غطاء على الشريحة وأغلقه بطلاء الأظافر.
   4. تنزلق الحرارة في جهاز PCR عند 90 درجة مئوية لمدة 10 دقائق وتقوم بالاحتضان في غرفة رطبة طوال الليل عند 45 درجة مئوية أو درجة حرارة مثالية محددة في الخطوة 1.4.11.
   5. قم بتبريد السلايدات عند 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة، وإزالة انزلاقات الغطاء، واغمر الشرائح في مخزن SSC تسلسلي كما يلي: 4x SSC لمدة 10 دقائق، 4x SSC مسخن مسبقا (45 °C)، مرتين SSC لمدة 20 دقيقة، مرتين SSC لمدة 10 دقائق، و0.2x SSC لمدة 10 دقائق.
4. الكشف باستخدام الأجسام المضادة المتقاربة مع AP المضادة ل DIG
   1. اغسل الشرائح في MABT لمدة 5 دقائق.
   2. قم بعرقلة بمحلول الانسداد من 50 إلى 400 ميكرولتر مع 1٪ Tween 20 لمدة 20 دقيقة.
   3. أضف 50 إلى 400 ميكرولتر من الأجسام المضادة المضادة DIG-AP مخففة في محلول حاجب (1:1,000) وحضن عند 37 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة.
   4. اغسل الشرائح في MABT لمدة 10 دقائق.
   5. اغمر الشرائح في مخزن الكشف الذي يحتوي على 1٪ من Tween 20 لمدة 5 دقائق.
   6. عالج ب 50 إلى 400 ميكرولتر من 1 ملليمولار ليفاميسول (في محلول كشف يحتوي على 1٪ Tween 20) لمدة 5 دقائق لتعطيل الفوسفاتاز القلوي الداخلي.
   7. وزع 50 إلى 400 ميكرولتر من محلول NBT/BCIP المخلوط مسبقا (مخفف في مخزن الكشف عند 1:100) على كل عينة وحضن الشرائح في غرفة رطبة عند RT لمدة 2 إلى 3 ساعات حتى تصبح الإشارة المطورة مرضية.
   8. اشطف السلايدات بماء منزوع الأيونات لإيقاف الرؤية ووضع 50 إلى 400 ميكرولتر من 0.05٪ [وزن/فول] ميثيل أخضر كصبغة مضادة عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
   9. اشطف الشرائح بماء منزوع الأيون، جفف بإيثانول 100٪، ثم اغمر في الزيلين.
   10. ضع 80 ميكرولتر من محلول التثبيت على كل شريحة وغطها بشرائح تغطية.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
أنهيدريد الخليك	سيغما	6404
محلول كبريتات ديكستران 50٪	ميليبور	S4030
حل 50X دينهاردت	سيغما	D2532
الديإيثيل بيروكربونات (DEPC)	سيغما	P159220
مجموعة وسم وكشف الحمض النووي Digoxigenin (DIG)	روش	11 093 657 910
الفوراميد	سيغما	F9037
قلم إم إدج™	داكو	H-400
ليفاميسول	المسار	SP-5000
كلوريد المغنيسيوم	سيغما	246964
حمض الماليك	سيغما	M0375
ميثيل أخضر	سيغما	M6776
بارافورمالديهايد	سيغما	P1648
بيرمونت	فيشر	SP15-500
محلول الحمض النووي للحيوانات المنوية في السلمون	إنفيتروجين	#15632-011
كلوريد الصوديوم	سيغما	S9625
سترات الصوديوم	دوكسان	D1420
كبريتات الصوديوم الدوديسيل	أمريسكو	227
ثلاثي إيثانولامين-HCl	سيغما	90279
تريس-HCl	البحث العضوي	3098T