التصوير اللحظي للعدوى البكتيرية في نموذج الفأر باستخدام التلألؤ الحيوي

الملخص

المصدر: فالنتاين، م. إ.، وآخرون، توليد طفرات حذف الجينات داخل الإطار في سودوموناس aeruginosa واختبار تخفيف الضراوة في نموذج فأر بسيط للعدوى. J. Vis. Exp. (2020)

يوضح هذا الفيديو استخدام نهج تصوير قائم على التلألؤ الحيوي لمراقبة العدوى البكتيرية في نموذج فأر حي. يتيح التصوير المتوهج البيولوجي والأشعة السينية التصوير في الوقت الحقيقي وتحديد مواقع تشريحية للعدوى المنتشرة في جميع أنحاء المضيف.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات المتعلقة بنماذج من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس مراجعة الطب البيطري في JoVE.

تصور العدوى بالإضاءة الحيوية

1. لرؤية تقدم العدوى، يتم إدخال أوبيرون متوهج حيوي كروموسومي (luxCDABE) في سلالات Pseudomonas aeruginosa PGN5 وVE2 التي تم اختبارها. تم تطوير البلازميدات والبروتوكول المستخدم لوضع علامات على هذه السلالات في مختبر شفايزر وقد لا يكون متوافقا مع جميع الأنواع/السلالات البكتيرية. ومن المهم أن تصور العدوى اختياري؛ لذا، لا يكون إدخال هذا الأوبرون جينوميا ضروريا لإجراء دراسة الوفيات.
2. جهز وتحقق من الإجهادات. بالإضافة إلى ذلك، تحقق من وجود التوهج الحيوي في السلالات الموسومة في كل خطوة تحقق.
3. بعد تحضير السلالات، حقن في مجموعات من 10 بالسلالات المضيئة الحيوية وفقا للخطوات السابقة.
4. صور كل 3 ساعات لمدة 24 ساعة باستخدام نظام تصوير قادر على التلألؤ الحيوي.
   1. أولا، جهز المصور عن طريق ضبط معلمات الكاميرا وتسخين المسرح للحيوانات. ثم اضبط تدفق الأكسجين إلى 1.5 لتر في الدقيقة (أو اتبع توصيات الشركة المصنعة).
   2. بعد تثبيت جهاز التصوير والمرحلة، ضع فأرا واحدا في غرفة التخدير مباشرة بعد الحقن وأعط 3.5٪ إيزوفلوران في الحجرة مع تدفق_{O 2} لمدة حوالي 4 دقائق. قد تختلف طرق التخدير حسب الحجرة و/أو العامل المخدر المستخدم؛ اتبع توصيات الشركة المصنعة. حدد التخدير المناسب من خلال اختبار الانسحاب الانعكاسي.
   3. انقل الفأرة إلى مرحلة تثبيت درجة الحرارة. ضع الفأر على ظهره مع مد ذراعيه ووضع مخروط أنف لإعطاء إيزوفلوران بنسبة 2.5٪ طوال عملية التصوير.
   4. أغلق الباب والتقط صورا مضيئة حيويا وأشعة سينية للفأرة.
   5. عند الانتهاء من التصوير، أعد الفأرة إلى قفصها وراقبها. يجب أن يستعيد الفأر وعيه خلال 3-5 دقائق.
   6. استمر في تصوير الفأرة كل 3 ساعات لمدة 24 ساعة، وفي كل مرة باستخدام فأرة مختلفة من كل مجموعة. لا تعيد تصوير الفأر خلال 24 ساعة بسبب احتمال حدوث آثار جانبية من إعادة التعرض للتخدير. يجب أن يتلقى فأر واحد جرعة واحدة فقط من التخدير كل 24-36 ساعة. نظف منصة التصوير بعد تصوير كل فأرة. قم بإيقاف تشغيل جهاز التصوير بين نقاط زمنية التصوير.
      ملاحظة: التلألؤ البيولوجي سيتلاشى بغض النظر عن السلالة التي يتم حقنها. تختلف شدة وطول عمر التوهج الحيوي حسب عوامل عديدة، منها عدد البكتيريا المحقونة، سلالة الفأر، السلالة البكتيرية، وغيرها.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
حوض أكيو للحمام الجاف الرقمي	لابنت	NC0205808	عبر فيشر ساينتيفك
حاضنة مجلس الوزراء	VWR	1540
إيزوثيزيا إيزوفلوران	هنري شاين لصحة	29405
نظام التصوير داخل الجسم الحي IVIS Lumina XRMS Series III	بيركنز وإلمر	CLS136340
جهاز الكهروبراتور الميكرونبضي	بيوراد	1652100
بريزم 7	جراف باد		https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/
مقياس الطيف الفوتومتري سمارت سبيك بلس	بيو-راد	170-2525	أو الطريقة/البائع المفضل
مرشحات نظام التخدير XAF-8	بيركنز وإلمر	118999
نظام تخدير الغاز XGI 8	علوم الحياة الكاليبر/زينوجين