تصور عدوى المسالك البولية في نموذج فأر باستخدام التوهج الحيوي

الملخص

المصدر: لويتس، ن. وآخرون. المتابعة الطولية لالتهابات المسالك البولية وعلاجها في الفئران باستخدام التصوير التوهج الحيوي. J. Vis. Exp. (2021).

يوضح هذا الفيديو تحفيز وتتبع عدوى المسالك البولية في نموذج فأر باستخدام إشريكية كولوم متوهجة حيويا تحقن في المثانة، حيث يحدث التصاق البكتيريا والغزو والتكاثر داخل الخلية. يعمل الضوء المنبعث من الأوبيرون المضيء الحيوي كمؤشر فوري على حمل البكتيريا أثناء تقدم العدوى.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات المتعلقة بنماذج من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس مراجعة الطب البيطري في JoVE.

1. تلقيح

1. تحضير
   1. اختر السلالة المرغوبة من الفأر حسب سؤال البحث وتوفر خطوط الإقصاء، والتفاصيل التجريبية، والاختلافات في الحساسية لعدوى المسالك البولية. ضع في اعتبارك أن القسطرة عبر الإحليل أسهل لدى إناث الفئران. لا تستخدم التي تقل عن 8 أسابيع، لأنها غير ناضجة مناعيا. هنا، تم استخدام فئران إناث عمرها 12 أسبوعا من نوع C57Bl/6J.
   2. اطلب مسبقا ودعها تتأقلم، ويفضل أن يكون ذلك لمدة 7 أيام. تجمع في أقفاص مهواة بشكل فردي، تحت ظروف ضوء/ظلام قياسية لمدة 12 ساعة.
   3. احلق منطقة البطن في للحد من فقدان الإشارة. لا تستخدم كريم إزالة الشعر، لأنه قد يحرق جلد بسرعة. قيد بإمساك الطرف الخلفي والأطراف الخلفية بقوة باليد غير المسيطرة أثناء الحلاقة باليد المسيطرة على. بدلا من ذلك، الحلاقة تحت تخدير إيزوفلوران.
      ملاحظة: تم حلق قبل يومين من التصوير، نظرا لأن ستعتني بالمنطقة المحلوقة أكثر.
   4. قدم الماء والطعام القياسي حسب الرغبة طوال فترة التجربة. ومع ذلك، حرم من الماء قبل ساعتين من الغرس لتقليل حجم المثانة أثناء الغرس.
   5. قم بتركيب طرف قسطرة معقمة بسعة 24 جالون على حقنة بسعة 100 ميكرولتر واملأ الحقنة بالمحلول البكتيري.
      ملاحظة: لتحديد توهج الخلفية، احصل على صورة أساسية قبل الغرس (انظر الخطوة 2 أدناه).
2. غرس
   1. ضع في غرفة حث وتخديرها باستخدام استنشاق الإيزوفلوران مع الأكسجين النقي كغاز حامل (الحث بنسبة 3٪ والصيانة بنسبة 1.5٪).
   2. ضع واحدا على سطح عمل في وضعية الاستلقاء على الظهر وحافظ على تخدير إيزوفلوران مستقر باستخدام مخروط أنف أثناء الغرس. ضع مرهم العين.
   3. طرد البول المتبقي عن طريق تطبيق ضغط لطيف والقيام بحركات دائرية على منطقة فوق العانة. نظف الجزء السفلي من البطن بنسبة 70٪ إيثانول قبل الغرس.
   4. قم بتزييت طرف القسطرة بمحلول ملحي عادي. ضع إصبع السبابة من اليد غير المسيطرة على البطن وادفعه برفق إلى الأعلى. ابدأ قسطرة الإحليل بزاوية 90° (عموديا) وعند مواجهة المقاومة، قم بإمالته أفقيا قبل إدخاله أكثر (0.5 سم).
      ملاحظة: لا تدفع القسطرة بالقوة أبدا، لأن ذلك قد يسبب ضررا للإحليل. يمكن أن تساعد الحركات اللطيفة في إدخال القسطرة. من ناحية أخرى، عادة ما يشير نقص المقاومة إلى إدخال خاطئ في المهبل.
   5. قم بعملية غرس بطيئة (5 ميكرولتر/ثانية) لكمية 50 ميكرولتر من اللقاح البكتيري (2 × 10⁷ وحدة CFU).
      ملاحظة: الأحجام الأعلى أو الغرس الأسرع قد يسبب ارتجاعا في الكلى. أثناء ممارسة التقنية، يمكن استخدام الحبر الأزرق لتقييم الارتجاع.
   6. بعد الغرس، أبق الحقنة والقسطرة في مكانهما لبضع ثوان أخرى ثم اسحب الحقنة ببطء لمنع التسرب. سجل أي شذوذات مثل ارتفاع كبير من التسرب أو وجود نسيج دموي واستبعد إذا لزم الأمر.
   7. ضع في وضعية الاستلقاء على الظهر عند مخروط الأنف في غرفة التصوير وكرر الخطوات السابقة 1.1.1-1.1.6 لجميع المتبقية. استخدم قسطرة واحدة لكل مجموعة تجريبية. تأكد من استمرار التخدير وتقليل الوقت بين الأول والأخير من التخدير.
   8. إذا لزم الأمر، أعط المضادات الحيوية أو الأدوية التجريبية قبل أو بعد التصوير (الخطوة 2). على سبيل المثال، لإعطاء الإنروفلوكساسين، أضف 40 ميكرولتر من محلول الإنروفلوكساسين (100 ملغ/مل) إلى 3.96 مل من محلول ملحي فسيولوجي للحصول على تخفيف بنسبة 1/100. حقن 100 ميكرولتر/10 جرام تحت الجلد في الساعة 9 صباحا و5 مساء لإعطاء 10 ملغ/كغ من الإنروفلوكساسين مرتين يوميا لمدة 3 أيام.

2. تصوير التوهج الحيوي

1. إعداد واختيار معلمات التصوير
   1. افتح برنامج اقتناء BLI (انظر جدول المواد) وانقر على تهيئة في جهاز التصوير (انظر جدول المواد) لاختبار نظام التحكم بالكاميرا والمسرح وتبريد كاميرا CCD إلى -90 درجة مئوية.
      ملاحظة: خلال هذه العملية، يتم قفل الباب، ويمكن متابعة تقدم التهيئة عبر لوحة التحكم. يشير الضوء الأخضر إلى أن درجة الحرارة التي تصل إلى -90 درجة مئوية قد وصلت. سيظهر تحذير إذا تم محاولة التصوير قبل اكتمال عملية التهيئة.
   2. تأكد من حفظ البيانات تلقائيا: انقر على الحفظ التلقائي للاكتساب واختر المجلد الصحيح.
   3. اختر اللمعان والتصوير. تحقق من إعدادات التلميع الافتراضية: اضبط مرشح الإثارة على Block وفلتر الانبعاث على Open.
   4. اضبط وقت التعريض التلقائي عند التقاط الصورة الأولى، خاصة عند توقع إشارة خافتة، لضمان عدد كاف من عدد الفوتونات. لقياسات الجسم الحي والإشارات الساطعة، اضبط زمن التعريض إلى ~30 ثانية. إذا كانت الصورة مشبعة، سيظهر تحذير. إذا حدث ذلك، قلل من وقت التعرض.
   5. اختر المتوسط Binning، F/stop 1، واختر مجال الرؤية الصحيح (FOV) (D لخمسة).
   6. اضبط ارتفاع الموضوع إلى 1 سم عند تصوير الفئران.
   7. انقر على إضافة ثلاث مرات في لوحة التحكم الخاصة بالاكتساب للحصول على تسلسل من ثلاث صور، مع تكرار التقنيات التقنية.
2. التصوير
   1. ضع الفئران في غرفة التصوير في وضعية الاستلقاء واستخدم مخروط أنف المانيفولد للحفاظ على التخدير (إيزوفلوران 1.5٪) طوال التجربة. صور حتى 5 فئران في نفس الوقت وافصل باستخدام حاجز الضوء لمنع الانعكاس.
   2. أغلق الباب واضغط على Acquire لبدء تسلسل التصوير.
   3. املأ معلومات مفصلة عن التجربة (البرية القابلة للضرب، العلاجات، يوم التصوير، إلخ). يتم حفظ إعدادات التصوير، مثل وقت التعريض، تلقائيا.
   4. أخرج الفئران من غرفة التصوير وأعيدها إلى قفصها. تحقق من التعافي الكامل بعد التخدير. خلال دقائق، يجب أن تكون مستيقظة تماما وتستكشف الآن. لا تقدم مسكنات للألم لأن ذلك قد يتعارض مع علاج التهاب المسالك البولية.
   5. أعد الأقفاص إلى الرفوف المهوية حتى دورة التصوير التالية. بعد الانتهاء من التجربة، قم بقتل بالاختناق_أو خلع عنق الرحم بسبب ثاني أكسيد الكربون. قم بذلك قبل التعافي من تخدير الإيزوفلوران لتقليل الضيق

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
جهاز تبخير التخدير	هارفارد أبريتوس ليمتد	لا يوجد	https://www.harvardapparatus.com/harvard-apparatus-anesthetic-vaporizers.html
بايتريل 100 ملغ/مل	باير	لا يوجد	إنروفلوكساسين
BD Insyte Autoguard 24 GA	BD	382912	قسطرة أصفراء، استخدم رأس بلاستيكي معقم للغرس
فئران C57Bl/6J	جانفييه	لا يوجد
الطرد المركزي 5804R	إبندورف	EP022628146
دروب سينس 16	مختبرات غير مقيدة	ترينيان	لقياس OD 600 نانومتر
محلول ملحي مخزن الفوسفات من دولبيكو، Gibco	ثيرموفيشر ساينتيفيك	المرجع 14040-083
الإيثانول 5 لتر مصاب بنسبة 70٪	VWR الدولي	85825360
أنبوب بوليسترين دائري قاع فالكون 14 مل، غطاء مكبس	كورنينغ	352057
فالكون خلية 50 مل	غرينر	227285
حقنة هاميلتون GASTIGHT، قفل PTFE لوير، 100 ميكرولتر	سيغما-ألدرتش	26203	لضمان ترسيخ بكتيريا بطيء بمقدار 50 ميكرولتر
حلقة التطعيم	روث	6174.1	حامل: الفن. رقم 6189.1
Iso-Vet 1000mg/g	منتجات ديكرا البيطرية	لا يوجد	إيزوفلوران
نظام التصوير في طيف IVIS في الجسم الحي	بيركينإلمر	124262 المرجع	جهاز تصوير