تحضير زراعة البكتيريا الزراعية لنقل الجينات إلى خلايا النبات

الملخص

المصدر: شي، ج. وآخرون، فحص وتحديد مثبطات إسكات الحمض النووي الريبي من المؤثرات المفرزة لمسببات الأمراض النباتية. J. Vis. Exp. (2020)

يوضح هذا الفيديو إجراء تحضير مزرعة Agrobacterium tumefaciens عن طريق تحفيز التعبير الجيني الضراوي باستخدام الأسيتوسيرينجون، ثم إزالة المضادات الحيوية عن طريق الغسل وإعادة التعليق، لتوليد تعليق جاهز للتحول لنقل الجينات إلى أنسجة النبات.

البروتوكول

1. تحضير زراعة البكتيريا الزراعية للتسريب

1. اختر مستعمرة إيجابية من صفيحة لوريا-بيرتاني (LB) وقم بتلقيح الخلايا في أنبوب زجاجي يحتوي على 5 مل من وسط LB مع 50 ميكروغرام/مل كاناميسين و50 ميكروغرام/مل ريفامبيسين. نما الخلايا عند 30 درجة مئوية مع هز 200 دورة في الدقيقة لمدة 24−48 ساعة.
2. انقل 100 ميكرولتر من الزراعة إلى 5 مل من وسط LB مع نفس المضادات الحيوية، و10 ملليمول من حمض الإيثانيسلفونيك 2-(N-مورفولينو) (MES؛ pH 5.6)، و20 ميكرومولار أسيتوسيرينجون (AS). ننمو البكتيريا عند 30 درجة مئوية مع هز عند 200 دورة في الدقيقة لمدة 16−20 ساعة.
3. خلايا الطرد المركزي عند 4000 × جرام لمدة 10 دقائق. أسكب المادة الفائقة وأعد تعليق الحبيبة في 2 مل من محلول MgCl₂ بسعة 10 ملليمتر.
4. كرر الخطوة 1.3 لضمان الإزالة الكاملة للمضادات الحيوية.
5. تحديد كثافة مزرعة البكتيريا الزراعية بقياس الكثافة البصرية عند 600 نانومتر (OD₆₀₀). اضبط إلى OD₆₀₀ بقيمة 1.5−2.0 مع مخزن 10 mM MgCl₂ .
6. أضف 10 مللي مولار MES (pH 5.6) و150 ميكرومولار AS إلى الثقافات المعلقة النهائية وحضن الخلايا عند RT لمدة لا تقل عن 3 ساعات دون اهتزاز.
   ملاحظة: لا تترك زراعة التعليق النهائية بين ليلة وضحاها.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
حمض مورفولينوإيثانيسلفونيك 2 (MES)	بيوفروكس	1086GR500	المخزن المؤقت
الأسيتوسرينجون (AS)	سيغما-ألدرتش	D134406-5G	استنشاق البكتيريا الزراعية
أغار	سيغما-ألدرتش	A1296-1KG	LB متوسط
باكتو تريبتون	بكالوريوس العلوم الحيوية	211705	LB متوسط
استخراج خميرة البكتو	بكالوريوس العلوم الحيوية	212750	LB متوسط
كبريتات كاناميسين	سيغما-ألدرتش	K1914	المضادات الحيوية
ريفامبيسين	MP Biomedicals	219549005	المضادات الحيوية
كلوريد الصوديوم	أمريسكو	0241-10 كجم	LB متوسط