تحضير نسيج مثانة الفئران لرؤية العدوى البكتيرية

Abstract

المصدر: أوبراين، في. بي.، وآخرون، عدوى متكررة في المسالك البولية بسبب التعرض للمثانة المهبلية في الفئران . تجربة J. Vis. (2020)

يوضح هذا الفيديو استخدام المجهر الإلكتروني الماسح لتصوير استعمار البكتيريا وتفاعلات المضيف مع الممرض في ظهارة المثانة لنموذج فأر مسبق العدوى.

Protocol

تمت مراجعة جميع الإجراءات المتعلقة بنماذج من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس مراجعة الطب البيطري في JoVE.

1. تصوير المثانات باستخدام المجهر الإلكتروني الماسح

   ملاحظة: يمكن إجراء هذا الإجراء في أي نقطة زمنية يرغب فيها في رؤية البول. كما هو موضح في الشكل 1 (الصناديق البنفسجية)، يمكن رؤية التفاعلات الممرضة لعدوى الإشريكية القولونية (UPEC) - الخصلية البولية بشكل أفضل بين 6 ساعات و24 ساعة بعد تلقيح UPEC خلال مرحلة تكوين الخزان، ويتم رؤية التقشير الإسيلي المرضي الناتج عن غاردنيلا مهبليا بين 3 ساعات و12 ساعة بعد التعرض الثاني ل G. vaginalis .

   1. تثبيت المثانة في الموقع
      1. حضر المثبت مباشرة قبل حصاد المثانة بإضافة جلوتارالديهايد (2.5٪ نهائي) وبارافورمالديهايد (2٪ نهائي) في محلول كاف كاكوديلات الصوديوم بحجم 0.15 مليون مع 2 ملليمول من CaCl₂ عند درجة حموضة 7.4. استخدم بارافورمالديهايد وجلوتارالديهيد من الأمبولات الزجاجية المفتوحة حديثا، حيث يتأكسد كلا المثبتين مع مرور الوقت في الحاويات المفتوحة. تحذير: غلوتارالديهايد سام، مهيج للتنفس، ومسبب للتآكل؛ البارافورمالديهايد قابل للاشتعال، مسرطن، مهيج، وسم تناسلي؛ كاكوديلات الصوديوم سام ومسرطن.
      2. لصنع 50 مل من المحلول التثبيتي، أضف 6.25 مل من 16٪ بارافورمالديهايد، و2 مل من 50٪ جلوتارالديهايد، و16.75 مل من الماء فائق النقاء إلى 25 مل من محلول 0.3 مولار من كاكوديلات الصوديوم عند درجة حموضة 7.4 مع 4 ملليمول CaCl₂.
      3. سخن المثبت المحضر إلى 37 درجة مئوية قبل إعطائه للمثانة.
      4. املأ حقنة التيوبركولين ذات الطرف المثبت وثبت قسطرة في الطرف، بحيث يكون الطرف المائل متجها لعلامات الحقنة المعاكسة. اقطع الأنبوب الزائد بمقدار 1-2 مم من نهاية الإبرة، مع الحرص على عدم كشف طرف الإبرة. حرك الحقنة لإزالة الفقاعات وادفع المكبس إلى الهواء الفارغ واملأ القسطرة بالمثبت فوق أنبوب طرد مركزي دقيق لجمع أي مثبت للتخلص السليم.
      5. تخدير الفأر وتضحي به باستخدام طريقة معتمدة (مثل خلع عنق الرحم تحت التخدير). ضع الفأرة على سطح التشريح مع تثبيت الأرجل (باستخدام أربطة مطاطية أو دبابيس). افتح منطقة الحوض للفأر باستخدام الملقط وزوج من المقص الجراحي لتكشف المثانة. ادفع الدهون المجاورة بحذر جانبا لكن اترك المثانة في مكانها.
      6. امسك الحقنة باليد المسيطرة مع توجيه الإبرة للأسفل وحافة الإبرة وعلامات الحقنة موجهة بعيدا عنك. اغمس طرف القسطرة في مادة مزلقة معقمة.
      7. ضع طرف القسطرة عند فتحة الإحليل، مع إبقاء ماسورة الحقنة بزاوية 30-45° فوق جسم الفأرة.
      8. اضغط باتجاه الأسفل بحركة صغيرة جدا باتجاه عقارب الساعة مع الطرف وأدخل القسطرة بلطف في الإحليل. عندما يدخل طرف القسطرة الإحليل، قم بتوجيه الحقنة نحو ذيل الفأر مع الاستمرار في تمرير القسطرة إلى داخل الإحليل حتى يصبح فوهة الحقنة موازية لسطح العمل. يجب أن يدخل عمود إبرة القسطرة بالكامل (باستثناء القاعدة) إلى الفأرة، مما يضع طرف القسطرة داخل تجويف المثانة.
      9. قم بتوصيل 50-80 ميكرولتر من المثبت ببطء، مما يجعل المثانة تنتفخ مثل البالون. حافظ على القسطرة في مكانها وارفع الحقنة قليلا، مع ميل الطرف للأعلى.
      10. باستخدام اليد الأخرى، افتح هيموستات وادخل شوكة تحت إبرة القسطرة عند تقاطع الإحليل. أغلق النسيج الدموي جزئيا حتى يلامس الإبرة فقط.
      11. قم بإخراج إبرة القسطرة بلطف من المثانة مع تثبيت وتثبيت الهيموستات بالكامل لمنع فقدان المثبت.
      12. أمسك بالجهاز بحيث يكون موازيا لسطح العمل مع استقرار المثانة فوقه. ارفع الأنبوب بلطف وقطع بحذر تحت الجانب المقابل من المثانة لإزالة المثانة التي لا تزال الهيموستا متصلة.
      13. ضع المثانة والدم المثبت في أنبوب فالكون يحتوي على مثبت دافئ. تأكد من أن المثانة مغمورة بالكامل في السائل وليست مضغوطة بجدران الأنبوب. حضن عند 4 درجات مئوية لمدة 24 ساعة.
   2. معالجة المثانة والتصوير باستخدام المجهر الإلكتروني الماسح (SEM)
      1. اقطع المثانة إلى نصفين بشفرة حلاقة نظيفة مزدوجة الوجهين، وقم بعمل قطع ثان مماسي للنصف لتحرير المثانة. ينتج عن ذلك كوبين نصف المثانة. إذا كانت هناك أي وسادات دهنية متبقية على الجزء الخارجي من المثانة، قم بإزالتها بلطف.
      2. اشطف نصف المثانة ثلاث مرات (10 دقائق لكل منهما) في محلول كاكوديلات الصوديوم (0.15 م، درجة حموضة 7.4).
      3. صبغ النسيج برباعي أكسيد الأوزميوم بنسبة 1٪ في حاجز كاكوديلات بحجم 0.15 متر لمدة ساعة في درجة حرارة الغرفة. الأوزميوم حساس للضوء؛ لذا، قم بهذه الخطوة باستخدام وعاء التلوين الملفوف بورق الألمنيوم للحفاظ على بيئة مظلمة. ​
         تحذير: رباعي أكسيد الأوزميوم سام ومزعج للبشرة. قم بهذه الخطوة في غطاء البخار مع القفازات.
      4. اشطف نصف المثانة ثلاث مرات (كل مرة 10 دقائق) في ماء فائق النقي. خلال هذه الخطوات، يمكن أحيانا رؤية الزيت المتناضح على سطح الماء. قم بسحب أو امتصاص هذا لتجنب التلوث أثناء خطوات التجفيف.
      5. جفف الأنسجة عن طريق الغمر في سلسلة إيثانول متدرجة (50، 70، 90، 100، و100٪) لمدة 10 دقائق لكل منها.
      6. جفف الأنسجة الثابتة باستخدام مجفف نقاط حرجة، مع إجراء 12_{تبادل ثاني} أكسيد الكربون بأسرع سرعة. اضبط جميع الإعدادات الإضافية على البطء، باستثناء خطوة التهوية التي تم ضبطها على السريع.
      7. اقطع كل نصف مثانة مرة أخرى باستخدام شفرة حلاقة نظيفة ذات جانبين لتوليد 4 قطع إجمالية لتقليل انحناء العينة من أجل طلاء أكثر كفاءة، وسهولة التصوير في SEM، وكشف الأنسجة التي قد تكون ملتفة أثناء التجفيف.
      8. ثبت قطع المثانة على لسان لاصق كربوني موصل على جزء من الألمنيوم وارسم كمية صغيرة من اللاصق الفضي حول التلامس السفلي باستخدام عود أسنان، مع الحرص على منع الغراء الزائد من امتصاص السطح الداخلي للمثانة.
      9. استخدم مغطى بالتفريغ العالي لتغطية عينات القطع بمقدار 6 نانومتر من الإيريديوم. إذا استمرت العينات في الشحن، تأكد من طلاء مسار موصل إلى السطح بطلاء فضي وتغطية إضافية بمقدار 4 نانومتر من الإيريديوم.
      10. صور العينات باستخدام مجهر إلكتروني ماسح. بينما قد تختلف الظروف حسب المجهر المستخدم، فإن جهد متسارع 3 KeV مع تيار شعاعي 200 pA ومسافة عمل 12-13 مم كان يعمل بشكل جيد على جهاز Zeiss Merlin FE-SEM عند استخدام كاشف الإلكترونات Everhart-Thornley (SE2).

Results

الشكل 1. مخطط نموذج الفأر. يتم تمييز الجدول الزمني ليعكس المراحل أو الإجراءات للنموذج الموضح في البروتوكول. المرحلة الأولى (برتقالية): إنشاء خزانات الإشريكية القولونية الممرضة داخل الخلايا (UPEC). يتم تطعيم الفئران عبر الإحليل بجهاز ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
إبر 30G × 1/2	BD	305106	للقسطرة
ملقط مستقيم بحجم 5 1/2"	ماكيسون	487377	تثبيت المثانة في الموقع
معطف ACE 600 Sputter	لايكا		معالجة عينات SEM
قطع SEM من الألمنيوم	تيد بيلا	16111	معالجة عينات SEM
كلوريد الكالسيوم	خدمات الطوارئ الطبية	12340	تثبيت المثانة في الموقع
لسان لاصق كربوني موصل	تيد بيلا	16084-1	معالجة عينات SEM
الطلاء الفضي الموصل	تيد بيلا	16034	معالجة عينات SEM
جهاز تجفيف نقاط حرجة CPD 300	لايكا		معالجة عينات SEM
مشبك معدني من القمع الخلوي	Simport	M964B	تحليل البول الخلوي
الإيثانول	خدمات الطوارئ الطبية	15050	معالجة عينات SEM
الجلوكوز	سيغما	G7528	بالنسبة لوسط نمو NYCIII G. vaginalis
جلوتارالديهايد	خدمات الطوارئ الطبية	16320	تثبيت المثانة في الموقع
مجموعة التلوين Hema 3	فيشر	23123869	تحليل البول الخلوي
هيبس	سيلغرو	25-060-Cl	بالنسبة لوسط نمو NYCIII G. vaginalis
إيريديوم	تيد بيلا	91120	معالجة عينات SEM
ميرلين FE-SEM	زايس		المجهر الإلكتروني الماسح
جهاز تنقية المياه ميلي-كيو	ميليبور	IQ-7000	معالجة عينات SEM
رباعي أكسيد الأوزميوم	خدمات الطوارئ الطبية	19170	معالجة عينات SEM
بارافورمالديهايد	خدمات الطوارئ الطبية	15710	تثبيت المثانة في الموقع
أنابيب البولي إيثيلين	إنتراميدك	427401	للقسطرة
بروتوز بيبتون #3	فيشر	DF-122-17-4	بالنسبة لوسط نمو NYCIII G. vaginalis
شفرة حلاقة ذات حافتين مطلية ب PTFE	خدمات الطوارئ الطبية	72000	قطع المثانات لاستخدام SEM