عزل وزراعة البكتيريا من أجنة سمك الزرد لتقييم حمل العدوى

الملخص

المصدر: بيرنوت، أ.، وآخرون، فك وتصوير سبب وربط خراجات الفطر في أجنة سمك الزرد. ج. فيس. إكسبر. (2015).

يوضح هذا الفيديو بروتوكول لعزل وقياس خراج الفطر الفطري عن جنين سمكة الزرد المصاب. يتضمن الإجراء قتل الجنين الرحيم، وتحلل الأنسجة، والتجانس لإطلاق البكتيريا، يليه الطرد المركزي وإعادة التعليق في مخزن خافض للتوتر السطحي. وأخيرا، يتم تخفيف التعليق البكتيري بشكل تسلسلي، وتغطيتها على الأجار المكملة بالمضادات الحيوية، وحضانها لتمكين تكوين المستعمرة وقياسها.

البروتوكول

1. تحضير وتخزين لقاح الم. خراج
   1. حالات نمو M. abscessus
      1. قم بإخراج خراج M. absceus من مخزون جليسرول بدرجة -80°C إلى أجار Middlebrook 7H10 يحتوي على 10٪ من OADC و0.5٪ جليسرول (7H10OADc) وتم استكمالها بالمضاد الحيوي المناسب حسب مؤشر المقاومة الذي يحمله الناقل المشفر للبروتين الفلوري. حضن الألواح على حرارة 30 درجة مئوية لمدة 4-5 أيام.
      2. احصل على مستعمرة فطرية إيجابية للفلورة وقم بتلقيح 1 مل من مرق ميدلبروك 7H9 مع مكمل ب OADC، 0.2٪ جلسرول، 0.05٪ Tween 80 (7H9OADc/T) مع المضاد الحيوي المطلوب في أنبوب بلاستيك معقم بحجم 15 مل. حضن على حرارة 30 درجة مئوية لمدة أسبوع دون ارتجاف.
         ملاحظة: التوين 80 تحد من التجمع والبكتيريا.
      3. أعد تعليق الزراعة المسبقة التي تم الحصول عليها في 2.1.2 في 50 مل من ميدلبروك 7H9OADc/T في قوارير زراعة الأنسجة بحجم 150 سم2 حتى يصل إلى 0.1 OD₆₀₀ (ما يعادل حوالي 5.107 بكتيريا/مل) ثم حضن الزراعة أكثر عند 30 درجة مئوية لمدة 4 أيام للحصول على زراعة تنمو بشكل أسي (OD₆₀₀ = 0.6 إلى 0.8).
         ملاحظة: لتقليل التكتل، خاصة في النوع الخشن، يجب ألا تتجاوز فترة الحضانة 5 أيام. كل من النسخ الناعمة والخشنة تظهر معدل نمو متشابه.
2. تحضير مسرحية M. abscessus inocula
   ملاحظة: نظرا للميل العالي لخشب M. abscessus الخشن لتكوين تجمعات كبيرة وإنتاج الحبال النارية، فإن هناك حاجة لعلاج خاص لتوليد لقاح متجانس ومتحكم فيه كمية قبل الحقن الدقيقة في الأجنة. يطبق هذا العلاج أيضا على البكتيريا الناعمة التي تنتج التجمعات، وإن كان بدرجة أقل من السلالة الخشنة.
   1. احصد المزارع التي تنمو بشكل أسي من قوارير زراعة الأنسجة بمساحة 150 سم2 عن طريق الطرد المركزي بقوة 4,000 x جرام لمدة 15 دقيقة في أنبوب بلاستيكي معقم بحجم 50 مل وأعد تعليق الحبيبات البكتيرية في 1 مل 7H9OADc/T. أليكوت 200 ميكرولتر من التعليق البكتيري داخل أنابيب الطرد المركزي الدقيق بحجم 1.5 مل.
      ملاحظة: العمل مع أحجام صغيرة في حقن بحجم 1 مل ضروري للحصول على تعليقات متجانسة للغاية.
   2. قم بتجانس التعليق البكتيري باستخدام إبرة 26-G (15 تسلسل صعود وهبوط)، ثم قم بسونيكات ثلاث مرات لمدة 10 ثوان (مع فواصل 10 ثوان بين كل تسلسل صوت) باستخدام جهاز صوت حمام الماء. أضف 1 مل من 7H9OADc/T وأعطيك دوامة لفترة وجيزة. الطرد المركزي لمدة 3 دقائق عند 100 × جاذبية.
   3. اجمع بعناية المواد الفائقة التي تحتوي على البكتيريا لتجنب التكتلات وجمع التعليق المتجانس في أنبوب بلاستيكي معقم بسعة 50 مل.
   4. تحقق بصريا من وجود تجمعات بكتيرية متبقية.
      ملاحظة: إذا كانت التجمعات لا تزال موجودة، انتقل إلى خطوة طرد مركزي إضافية عند 100 × جرام لمدة دقيقتين، واجمع السوبرناتان.
   5. قم بطرد المركزي بنظام التعليق عند 4000 × g لمدة 5 دقائق، ثم أعد تعليق القرص في 200 ميكرولتر 7H9OADc/T، ثم تابع الحقن.
   6. تقييم التركيز النهائي للبكتيريا عن طريق طلاء التخفيفات المتسلسلة (ب 1x PBST) على أجار 7H10OADc وعد وحدات تكوين المستعمرة (CFU) بعد 4 أيام من الحضانة عند 30 درجة مئوية. يجب تحديد وحدات CFU لكل دفعة جديدة.
   7. تحضير مخزونات التلقيح المجمدة عن طريق تخزين 5 ميكرولتر أليكوات عند -80 درجة مئوية.
      ملاحظة: تقييم الاتحاد الكيميائي للبكتيريا المجمدة التي تبلغ -80°C هو شرط أساسي لتحديد العدد الدقيق للبكتيريا الحية الفعالة، حيث قد يؤثر التجميد/الذوبان على بقاء اللقاح البكتيريا. هذه التلقيحات المجمدة جاهزة للاستخدام في الحقن اللاحقة. وبما أن جميع العليكوات تحتوي على نفس عدد CFU، فإنها تسمح بحقن البكتيريا بطريقة قابلة للتكرار من تجربة إلى أخرى.
3. مراقبة جودة اللقاح
   ملاحظة: يمكن استخدام تلوين زيل-نيلسن (الخاص بالبكتيريا الفطرية) لمقارنة جودة تعليق البكتيريا قبل وبعد إجراءات التجانس.
   1. ضع قطرة واحدة من التعليق البكتيري المتجانس على شريحة زجاجية وادعها تجف تماما. ثبت الطبقة لمدة لا تقل عن 30 دقيقة على صفيحة ساخنة مضبوطة على 65-70 درجة مئوية وصبغ باستخدام بروتوكول تلوين زيل-نيلسن.
   2. راقب مسحة البكتيريا باستخدام مجهر باستخدام هدف 100X وقارن مع مسحة تعليق بكتيريا غير معالجة (الشكل 1).

2. تحضير أجنة سمك الزرد

1. التكاثر وجمع بيض سمك الزرد
   1. في اليوم السابق للتفريخ، قم بتربية سمك الزرد البالغ عن طريق وضع ذكرين وأنثى واحدة (عادة ما تسمح بنسبة 2:1 بمعدل تخصيب مثالي) في غرفة تكاثر، تتكون من حوض سمك منفصل مع سلة جمع بيض.
      ملاحظة: تستخدم سلال جمع البيض لحماية البيض من أكل الوالدين وتسهيل حصاد البيض.
   2. عند 1 حصان قوة (hpf)، احصد البيض وفقط الأجنة الناتجة بشكل صحيح في طبق بتري بحجم 100 مم مملوء ب 25 مل من ماء السمك الأزرق (بحد أقصى 100 جنين في كل طبق) وحافظ على درجة حرارة 28.5 °م. يتم التخلص من البيض غير المخصب.
2. تحضير أجنة سمك الزرد للحقن
   1. بعد حوالي 24 ساعة من الإخصاب (hpf)، قم بإزالة الأجنة بملقط ناعم في طبق بتري بحجم 100 مم وحافظ عليها عند 28.5 درجة مئوية.
   2. اجمع الأجنة التي تبلغ 30-48 hpf باستخدام ماصة وانقلها إلى غرفة تحديد موضع على شكل "V" مملوءة ب 25 مل من ماء السمك يحتوي على 270 ملغ/لتر تريسين. وضع الأجنة بشكل صحيح في القنوات باستخدام أداة رأس ميكرولودر منزلية الصنع (رأس ميكرولودر مقطوع منزلي الصنع) محسنة لتسهيل التلاعب الدقيق بالدقة.
      ملاحظة: وجه الجانب الظهري للأسفل للحقن الوريدي في الوريد الذيلي أو الجانب الظهري للأعلى لحقن عضلات الذيل.

3. إجراء الحقن الدقيق

ملاحظة:. لتقييم تسلسل عدوى الخراج المالكتلندي (البقاء، الأحمال البكتيرية، الحركية، وخصائص العدوى)، يفضل الحقن في الوريد الذيلي لجنين بقوة 30 hpf. لرؤية تجنيد الخلايا المناعية، تجرى الحقن في مواقع محددة، مثل عضلات الذيل في جنين بقوة 48 حصانا.

1. تخفيف اللقاح الفطري في 1X PBST (حسب عدد ال CFU الذي سيتم إعطاؤه)، والذي يحتوي على 10٪ فينول أحمر للتحقق من صحة الحقن.
2. قم بتحميل إبرة حقن الشعيرات الدموية الدقيقة ب 5-10 ميكرولتر من اللقاح البكتيري باستخدام طرف محمل دقيق، وتوصيل إبرة الحقن الدقيق بحامل جهاز التلاعب الدقيق ثلاثي الأبعاد المتصل بالحقن، وكسر الجزء العلوي من الإبرة باستخدام ملقط دقيق للحصول على قطر فتحة يتراوح بين 5-10 ميكرومتر.
3. قم بمعايرة حجم الحقن بضبط ضغط الحقن الدقيق (20-50 هكتوباسكال) والوقت (0.2 ثانية).
   ملاحظة: يتم معايرة حجم الحقن المطلوب من خلال تحديد بصري لقطر القطرة المطرودة إلى صفار الجنين.
4. لحقن الوريد الذيلي، ضع الجنين بحيث يكون الجانب البطني مواجها للإبرة وضع طرف الإبرة بالقرب من فتحة البول التناسلية، مستهدفا الوريد الذيلي، وادفع طرف الإبرة بلطف داخل الجنين حتى تخترق منطقة الوريد الذيلي. توفر الحجم المطلوب من تحضير البكتيريا، عادة 1-3 نانولتر يحتوي على حوالي 100 CFU/nl.
5. للحقن العضلي، ضع الجنين بحيث يكون الجانب الظهري مواجها للإبرة، وضع الإبرة فوق سوميت واحد، وحقن كمية صغيرة (1 نانولتر) من اللقاح.
   ملاحظة: أما بالنسبة لحقن الأوردة الذيلية، فإن الحقن العضلي أيضا يصعب تنفيذه. يجب توخي الحذر لتجنب التحميل الزائد، الذي قد يؤذي الأنسجة المحيطة.
6. في نهاية عملية الحقن، تحكم في حجم اللقاح عن طريق حقن نفس حجم التعليق البكتيري في قطرة من PBST المعقم، ثم الطلاء على 7H10OADc وعد الوحدة المعتمدة (CFU). يمكن حقن حوالي 100 جنين بالإبرة.
   ملاحظة: نظرا لأن ال M. abscessus الخشن قد يستمر في تكوين تجمعات في الإبرة، يجب إجراء الحقن مباشرة بعد تحضير اللقاح.
7. نقل الأسماك المصابة بشكل فردي إلى صفائح بسعة 24 بئر تحتوي على 2 مل/بئر من ماء السمك وحضنة عند 28.5 درجة مئوية. يمكن استخدام الأجنة التي تم حقنها ب 1-3 نينولتر 1X PBS كأدوات تحكم.
8. يتم مراقبة العدوى الصحيحة للبكتيريا الفلورية في الأجنة باستخدام مجهر فلوري.

4. قياس كمية عبء البكتيريا

1. التحديد بواسطة تعداد CFU
   1. في النقطة الزمنية المطلوبة، اجمع مجموعات من الأجنة المصابة (5 لكل حالة) في أنابيب طرد مركزي دقيق بحجم 1.5 مل (جنين واحد لكل أنبوب)، وتخدير الأجنة بالتجميد عن طريق الحضانة على الثلج لمدة 10 دقائق، ثم القتل الرحيم باستخدام جرعة زائدة من التريساين (300-500 ملغ/لتر)
   2. اغسل الأجنة بالماء المعقم مرتين ثم وزعها في أنبوب جديد. قم بتحليل كل جنين يحتوي على 2٪ من ترايتون X-100 مخفف في 1X PBST باستخدام إبرة 26-G وتوحيد التعليق حتى التحليل الكامل. قم بعمل جهاز تعليق الطرد المركزي وإعادة تعليق القرص في 1X PBST بنسبة 0.05٪ Tween 80. يتم طلاء التخفيفات المتسلسلة للمتجانسات على ميدلبروك 7H10OADc وتكمل ب BBL MGIT PANTA، كما أوصى المورد.
      ملاحظة: خراجية الماتوبوس أكثر عرضة لعلاج NaOH من M. marinum. يمكن تحقيق تطهير محللات الأسماك دون التأثير على نمو خراج الماسترولين بنجاح باستخدام كوكتيل المضاد الحيوي BBL MGIT PANTA.
   3. حضن الصفائح لمدة 4 أيام عند درجة حرارة 30 درجة مئوية وعد المستعمرات.

النتائج

الشكل 1. تحضير مسرحية M. abscessus inocula المشتتة. تلوين زيل-نيلسن لمتغيرات R أو S المزروعة على وسط المرق قبل أي معالجة (الألواح العلوية) أو بعد العلاج (الألواح السفلية) لتقليل حجم وعدد التجمعات الميكوبكتيرية (خ...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
BBL MGIT PANTA	بكالوريوس العلوم الحيوية	245114
مصل البقر ألبومين	يوروميديكس	04-100-811-E
كاتالاز من كبد البقر	سيغما-ألدرتش	C40
ديفكو ميدلبروك 7H10 Agar	بكالوريوس العلوم الحيوية	262710
ديفكو ميدلبروك 7H9 Broth	بكالوريوس العلوم الحيوية	271310
ملح إيثيل 3-أمينوبنزوات الميثان سلفونات (تريكائين)	سيغما-ألدرتش	A5040
حمض الأوليك	سيغما-ألدرتش	O1008
بارافورمالديهايد	دلتا ميكروسكوبي	15710
فينول ريد	سيغما-ألدرتش	319244
توين 80	سيغما-ألدرتش	P4780
أغار	جيبكو لايف تكنولوجي	30391-023
أجاروز ذوبان منخفض	سيغما-ألدرتش
أملاح البحر الفورية	شركة أكواريوم سيستمز إنك
شعيرات زجاج بوروسيليكات	شركة ساتر إنسترومنت إنك	BF100-78-10	1 مم O.D. × 0.78 مم تعريف
جهاز سحب الميكروبايبت	شركة ساتر إنسترومنت		جهاز سحب الميكروبايبت المصنوع من اللهب/البني p-87
الحقن الدقيق	أبحاث ترايتيك		الميكروINJECTOR الرقمي، MINJ-D
الملقط	ساينس تولز إنك		دومونت # M5S
نصائح المكرولودر	إبندورف