نمذجة أمراض إيروموناس في C. elegans باستخدام اختبار البقاء

الملخص

المصدر: تشين، ي.، وآخرون. تقييم ضراوة ومسببات عدوى إيروموناس في نموذج التهاب الكاينورهابديتس الأمريكي . J. Vis. Exp. (2018)

يوضح هذا الفيديو اختبار البقاء باستخدام C. elegans لنمذجة مرض Aeromonas ، حيث يؤدي تناول البكتيريا عن طريق الفم إلى عدوى معوية ووفيات، مما يمكن من تقييم كمية لضراوة البكتيريا في نظام العائل الحي.

البروتوكول

1. اختبار البقاء على C. elegans مع Aeromonas

1. في يوم زراعة ديدان L1 على وسط نمو الديدان الخيطية المغنية ENGM التي تنتشر مع E. coli OP50، اختر مستعمرة واحدة من كل من سلالات Aeromonas الأربع أو E. coli OP50 وزراعة مرق 2 مل رطل على التوالي عند 37 درجة مئوية لمدة 16 ساعة.
   ملاحظة: لتجنب التلوث، يجب تنفيذ هذه الخطوة في غطاء تدفق طبقي. هنا، تم استخدام السلالات البكتيرية التالية: الإشريكية القولونية OP50، المصدر الغذائي الطبيعي ل C. elegans. A. dhakensis AAK1، أول عزل سريري ممرض ممرض بالكامل متسلسل. أ. هيدروفيليا A2-066، A. veronii A2-007، وA. caviae A2-9307121 هي عزلات سريرية ممثلة من مستشفى جامعة تشنغ كونغ الوطني.
2. قس امتصاص مرق البكتيريا_{OD 600} (الكثافة البصرية عند 600 نانومتر) واضبط المرق البكتيري إلى OD₆₀₀ = 2.0 باستخدام مرق LB.
3. ضع 30 ميكرولتر من مرق البكتيريا على كل لوح NGM (وسط نمو الديدان الخيطية) بقطر 6 سم. زرع الصحون في درجة حرارة الغرفة طوال الليل.
   ملاحظة: لتحضير NGM، قم بإذابة 3 جرام NaCl (كلوريد الصوديوم)، 2.5 جرام بيبتون بكتيريا، و20 جرام أجار في 1 لتر من الماء منزوع الأيون. جهاز تعقيم عند 121 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. انتظر حتى يبرد إلى 55 درجة مئوية في حمام مائي، ثم أضف 1 مل من 1 M CaCl₂ (كلوريد الكالسيوم)، و1 مل من 1 M MgSO₄ (كبريتات المغنيسيوم)، و1 مل من 5٪ كوليسترول في الإيثانول، و25 مل من مخزن الفوسفات. قم بتدوير المزيج جيدا.
4. في اليوم الذي تنمو فيه ديدان L1 إلى مرحلة L4، يتم اختيار ونقل 50 دودة عشوائيا إلى صفيحة NGM مع كل من سلالات أيروموناس الأربع أو E. coli OP50.
5. حضانة صفائح NGM عند 20 درجة مئوية حتى ينتهي الاختبار.
6. انقل جميع الديدان الحية إلى لوحة NGM جديدة محضرة تحتوي على بكتيريا وعد عدد الديدان الحية والميتة والديدان الحسية يوميا حتى تموت آخر دودة.
   ملاحظة: نقل الديدان يوميا إلى صفيحة NGM جاهزة حديثا للحفاظ على العدوى، حتى عند استخدام ديدان معقمة (مثل GLP-4 أو مع FudR).
7. رسم منحنيات البقاء بناء على حساب البيانات اليومي.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
حاضنة الهزاز	ييه دير	LM-570R	حضانة البكتيريا
NaCl	سيغما	31434	تحضير وسيط الزراعة
MgSO₄	سيغما	M7506	تحضير وسيط الزراعة
أغار	ديفكو	214530	تحضير وسيط الزراعة
CaCl₂	سيغما	C1016	تحضير وسيط الزراعة
الكوليسترول	سيغما	C8503	تحضير وسيط الزراعة
لوحة بتري بطول 6 سم	ألفا بلس	46	تحضير طبق الأجار
الببتون البكتيري	Affymetrix/USB	AAJ20048P2	تحضير وسيط الزراعة
FudR	سيغما	1271008	تحضير وسيط الزراعة
نظام المجهر	نيكون	إكليباز تي مقلوب	تصوير المجهر