تقييم ضراوة البكتيريا باستخدام اختبار سمية سائل C. elegans

Abstract

المصدر: تشين، ي.، وآخرون. تقييم ضراوة ومسببات عدوى إيروموناس في نموذج التهاب الكاينورهابديتس الأمريكي. J. Vis. Exp. (2018).

يوضح هذا الفيديو اختبار سمية السائل C. elegans باستخدام Aeromonas، وهي طريقة تستخدم لتقييم ضراوة البكتيريا عن طريق قياس بقاء الديدان في بيئة سائلة محدودة من حيث العناصر الغذائية. يكشف الاختبار عن ممرضية خاصة بالسلالة بناء على مدى الضرر الناتج عن السموم والوفيات في C. elegans.

Protocol

1. اختبار سمية سائل C. elegans باستخدام Aeromonas

ملاحظة: لتجنب التلوث، يجب تنفيذ الخطوات باستخدام غطاء تدفق طبقي.

1. في اليوم التالي لزراعة ديدان L1 على طبق ENGM (وسط نمو الديدان الخيطية) الذي ينتشر مع E. coli OP50، اجمع مستعمرة واحدة لكل من سلالات Aeromonas الأربع والإشريكية القولونية OP50، وزراعة مرق بوزن 5 مل لكل منها عند 37 درجة مئوية لمدة 16 ساعة.
   ملاحظة: في البروتوكول، تم استخدام السلالات البكتيرية التالية: الإشريكية القولونية OP50، المصدر الغذائي الطبيعي لكورديا البكتيريا العليا. A. dhakensis AAK1، أول عزل سريري ممرض ممرض بالكامل المتسلسل من A . dhakensis . أ. هيدروفيليا A2-066، A. veronii A2-007، وA. caviae A2-9307121 هي معزولات سريرية ممثلة من مستشفى تشنغ كونغ الوطني الجامعي.  
   ملاحظة: لتحضير NGM المخصب، قم بإذابة 3 جرام من NaCl، و5 جرام بيبتون بكتيريا، و1 جرام من مستخلص الخميرة، و30 جرام من الأجار في 1 لتر من الماء منزوع الأيون. جهاز تعقيم عند 121 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. انتظر حتى يبرد إلى 55 درجة مئوية في حمام ماء، ثم أضف 1 مل من 1 M CaCl₂، و1 مل من 1 M MgSO₄، و1 مل من 5٪ كوليسترول في الإيثانول، و25 مل من محلول الفوسفات. قم بتدوير المزيج جيدا.
2. قس امتصاص مرق البكتيريا بمقدار_{OD 600} .
3. قم بطرد مركزي بمرق البكتيريا بقوة 3,500 x جرام لمدة 15 دقيقة لإزالة مرق LB. أعد تعليق البكتيريا واضبط المرق البكتيري إلى جرعة زائدة₆₀₀ = 3.0 مع وسط S. أضف 195 ميكرولتر من المرق البكتيري في وسط S إلى 8 آبار على الأقل من صفيحة تحتوي على 96 بئرا.
   ملاحظة: تركيب وسط S: لتحضير وسط S، اخلط 40 مل من S Basal، 0.4 مل 1 M سترات بوتاسيوم، 0.4 مل من محلول المعادن الننزرة، 0.12 مل من 1 M CaCl₂، 0.12 مل من 1 M MgSO₄، 40 ميكرولتر من 5٪ كوليسترول في الإيثانول و1 مل من 8 ملليمول FudR قبل الاستخدام.
4. اغسل ديدان L4 على لوحة ENGM باستخدام إشريكية القولون OP5 باستخدام M9 متوسط. اضبط محلول الدودة إلى تركيز 5 ديدان لكل ميكرولتر وأضف 5 ميكرولتر من محلول الدودة إلى كل بئر من صفيحة 96 بئرا. تأكد من وجود حوالي 25 دودة في كل بئر.
5. حضن لوحة ال 96 بئر على جهاز هزاز بسرعة 200 دورة في الدقيقة عند 25 درجة مئوية.
6. عد عدد الديدان الحية والميتة بعد 24 و48 و72 ساعة. احسب معدلات بقاء كل بئر بالصيغة التالية: (ديدان حية/ديدان كلية) × 100٪.
7. ارسم رسم بياني مخطط التشتت مع حساب البيانات اليومية.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
حاضنة الهزاز	ييه دير	LM-570R	حضانة البكتيريا
NaCl	سيغما	31434	تحضير وسيط الزراعة
MgSO₄	سيغما	M7506	تحضير وسيط الزراعة
أغار	ديفكو	214530	تحضير وسيط الزراعة
CaCl₂	سيغما	C1016	تحضير وسيط الزراعة
الكوليسترول	سيغما	C8503	تحضير وسيط الزراعة
الإيثانول	سيغما	32205	تحضير وسيط الزراعة
KOH	سيغما	P5958	تحضير وسيط الزراعة
لوحة بتري بطول 6 سم	ألفا بلس	46	تحضير طبق الأجار
صفيحة ذات 96 بئر	فالكون	353072	التحليل السائل
الببتون البكتيري	Affymetrix/USB	AAJ20048P2	تحضير وسيط الزراعة
مستخلص الخميرة	سيغما	92144	تحضير وسيط الزراعة
حمض الستريك • H₂O	سيغما	حوالي 1909	تحضير وسيط الزراعة
سترات ثلاثي البوتاسيوم • H₂O	سيغما	104956	تحضير وسيط الزراعة
FudR	سيغما	1271008	تحضير وسيط الزراعة
ثنائي الصوديوم EDTA	سيغما	E1644	تحضير وسيط الزراعة
التريبتون	سيغما	16922	تحضير وسيط الزراعة
نظام المجهر	نيكون	إكليباز تي مقلوب	تصوير المجهر
كاميرا CCD العلمية	كيماجينغ	ريتيغا-2000R فاست 1394	تصوير المجهر