اختبار نخر العضلات في C. elegans الناتج عن سلالة ممرضة من Aeromonas

الملخص

المصدر: تشين، ي. وآخرون، تقييم ضراوة ومسببات عدوى إيروموناس في نموذج التهاب الكاينورهابديتس الغريب . J. Vis. Exp. (2018)

يوضح هذا الفيديو اختبار نخر العضلات في C. elegans (Caenorhabditis elegans) باستخدام سلالات Aeromonas الممرضة. من خلال تغذية الديدان التي تعبر عن البروتين الفلوري الأخضر (GFP) على ألواح بذور Aeromonas، يحاكي الاختبار العدوى البكتيرية ويكشف عن تلف الأنسجة من خلال التصوير الفلوري. يشير فقدان البنية العضلية وإشارة GFP التدريجي إلى استجابة نخرية ناتجة عن إيروموناس.

البروتوكول

1. اختبار نخر العضلات Caenorhabditis elegans باستخدام Aeromonas

ملاحظة: لتجنب التلوث، يجب تنفيذ هذه الخطوات في غطاء تدفق طبقي.

1. في اليوم الذي تزرع فيه ديدان L1 على وسط نمو الديدان الخيطية المغنية (ENGM) المنتشرة ب Escherichia coli OP50، قم باختيار مستعمرة واحدة لكل من سلالات Aeromonas الأربعة والإشريكية القولونية OP50 وزراعة مرق 2 مل من Luria-Bertani (LB) عند كل منها عند 37 درجة مئوية لمدة 16 ساعة. ملاحظة: هنا، تم استخدام السلالات البكتيرية التالية: الإشريكية القولونية OP50، المصدر الغذائي الطبيعي ل C. elegans. A. dhakensis AAK1، أول عزل سريري ممرض بالكامل متسلسل متواصل. أ. هيدروفيليا A2-066، A. veronii A2-007، وA. caviae A2-9307121 هي عزلات سريرية ممثلة من مستشفى جامعة تشنغ كونغ الوطني.
2. قس امتصاص مرق البكتيريا بمقدار_{OD 600} واضبط مرق البكتيريا إلى OD₆₀₀ = 2.0 باستخدام مرق LB. ضع 30 ميكرولتر من المرق البكتيري وانشر على ألواح نمو الديدان الخيطية بطول 6 سم. زرع الصحون في درجة حرارة الغرفة طوال الليل.
3. في اليوم الذي تنمو فيه ديدان L1 إلى مرحلة L4، يتم نقل 50 دودة إلى كل صفيحة NGM مع كل من سلالات Aeromonas الأربع أو E. coli OP50. حضن صفائح NGM عند 20 درجة مئوية. انقل الديدان كل 24 ساعة إلى صفائح NGM المحضرة حديثا مع البكتيريا.
4. التقط صور للعضلات باستخدام مجهر فلوري.
   1. اختر 10 ديدان عشوائيا على جل أغاروز بنسبة 2٪ بلون M9 متوسط على شريحة كهربائية. شل الديدان باستخدام 2 ميكرولتر من أزيد الصوديوم 1٪ في وسط M9 على الأغاروز لأقل من 5 دقائق قبل التقاط الصور.
   2. ضع غطاء والتقاط صور العضلات باستخدام فلتر بروتين فلوري أخضر (GFP) على مجهر فلوري مزود بكاميرا شحنة متصلة. التقط صور العضلات بعد 24 و48 و72 ساعة بعد مرحلة L4.

قم بإجراء تحليل الصور وتحضير الأشكال باستخدام برنامج معالجة الصور.
ملاحظة: تعريفات الدرجات ومستويات تلف العضلات موضحة في الشكل 1، حيث تم سرد المعايير كما يلي: 3 نقاط لنقص ألياف العضلات؛ نقطتان للألياف العضلية الممزقة أو المكسورة؛ نقطة واحدة لألياف العضلات المثنية؛ 0 نقاط لألياف عضلية صحية.

النتائج

الشكل 1: الدرجات المقابلة لنخر العضلات في C. elegans الناتج عن عدوى Aeromonas. معايير نخر العضلات والدرجات المقابلة هي كما يلي: 3 نقاط لألياف العضلات المفقودة؛ نقطتان للأ...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
حاضنة الهزاز	ييه دير	LM-570R	حضانة البكتيريا
K₂HPO₄	ج.ت. بيكر	MP021519455	تحضير وسيط الزراعة
KH₂PO₄	ج.ت. بيكر	3246-05	تحضير وسيط الزراعة
Na₂HPO₄	ج.ت. بيكر	MP021914405	تحضير وسيط الزراعة
NaCl	سيغما	31434	تحضير وسيط الزراعة
MgSO₄	سيغما	M7506	تحضير وسيط الزراعة
أغار	ديفكو	214530	تحضير وسيط الزراعة
CaCl₂	سيغما	C1016	تحضير وسيط الزراعة
الكوليسترول	سيغما	C8503	تحضير وسيط الزراعة
الإيثانول	سيغما	32205	تحضير وسيط الزراعة
KOH	سيغما	P5958	تحضير وسيط الزراعة
لوحة بتري بطول 6 سم	ألفا بلس	46	تحضير طبق الأجار
الببتون البكتيري	Affymetrix/USB	AAJ20048P2	تحضير وسيط الزراعة
مستخلص الخميرة	سيغما	92144	تحضير وسيط الزراعة
حمض الستريك • H₂O	سيغما	حوالي 1909	تحضير وسيط الزراعة
سترات ثلاثي البوتاسيوم • H₂O	سيغما	104956	تحضير وسيط الزراعة
FudR	سيغما	1271008	تحضير وسيط الزراعة
ثنائي الصوديوم EDTA	سيغما	E1644	تحضير وسيط الزراعة
FeSO₄·7H₂O	سيغما	215422	تحضير وسيط الزراعة
MnCl₷4H₂O	سيغما	221279	تحضير وسيط الزراعة
ZnSO₄·7H₂O	سيغما	204986	تحضير وسيط الزراعة
CuSO₄·5H₂O	سيغما	C8027	تحضير وسيط الزراعة
التريبتون	سيغما	16922	تحضير وسيط الزراعة
نظام المجهر	نيكون	إكليباز تي مقلوب	تصوير المجهر
كاميرا CCD العلمية	كيماجينغ	ريتيغا-2000R فاست 1394	تصوير المجهر